- 研究背景
冠状病毒近年来多次引发大型流行性疾病，如SARS、MERS及SARS-CoV-2等，而尚未有针对性的靶向药物。2003年，SARS–CoV(Severe Acute Respiratory Syndrome) 感染约 8000人，死亡率10%；2014年，MERS–CoV 死亡率比SARS更高，约达40%；而给全球带来危机和恐慌的新冠疫情的严重性远超前两者。3CLpro（Trypsin-Like Proteinase）作为冠状病毒的主要蛋白酶，在冠状病毒中高度保守，是病毒复制繁殖的关键酶，也是目前广谱抗单正链RNA病毒研究的重要靶点；且人体中没有与其相似的蛋白酶，因此是一个理想的抗病毒药物设计靶点，类似的蛋白酶抑制剂2003年SARS以来已经有大量的研究基础。例如非典期间United Christian医院C M Chu等将最早设计用来抑制HIV蛋白酶洛匹那韦（lopinavir）和利托那韦（ritonavir）用于41例SARS治疗，患者死亡率只有2.4%，比较此前的常规治疗过111个非典患者死亡率为28.8%有明显的治疗效果。此前已有报导二者可与SARS-CoV-2的3CLpro活性位点相互作用，但HIV蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族，而冠状病毒蛋白酶为丝氨酸蛋白酶家族，且HIV蛋白酶抑制剂专门针对HIV蛋白酶二聚体口袋优化，这个口袋在冠状病毒蛋白酶中并不存在，故拟针对SARS-CoV-2的3CL靶点进行针对性的蛋白酶抑制剂设计。
- 靶点介绍
病毒基因组是一条单链的正义RNA，大小约为30kb，包含相当多的开放阅读框。三分之二的病毒基因组编码16种非结构蛋白（nsp1–16），其余基因组编码4种结构蛋白和9种辅助蛋白（Orf3a、Orf3b、Orf6、Orf7a、Orf7b、Orf8、Orf9b、Orf9c和Orf10），3CL蛋白酶负责加工病毒的大部分非结构蛋白，包括RdRp以及复制-转录复合物（RTC）的其他亚基，是病毒进入人体细胞后释放出的RNA 直接与宿主的核糖体结合，翻译出的病毒复制所需的蛋白酶。
已报道的冠状病毒3CL蛋白酶晶体结构均为同源二聚体，构成二聚体的亚基包含三个结构域。N端为类似胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin-fold)结构的两个beta;折叠结构域(I和II)形成的催化结构域，由半胱氨酸和组氨酸构成的催化二联体位于结构域I和II形成的裂隙中；C端为一个由5个alpha;-螺旋形成的结构域III，又被称作螺旋结构域或C结构域，通过柔性环状结构(loop)与催化结构域II相连，主要参与蛋白酶的二聚。
- 研究现状
在Cortellis Drug Discovery Intelligence（科睿唯安）数据库种查询相关化合物，选择Drug Type为Small Molecules、Drug Target Classification为3C-Like Proteinase (3CL-Pro)(SARS-Cov-2;COVID-19)，查询得上市药物3个，Remdesivir、Favipiravir、Ribavirin，积极在研化合物5个，分散于一二三期及临床前研究阶段。
在Protein Data Bank网站上使用爬虫爬取相关数据，筛选含有小分子及多肽配体的数据，得到近七百条，但页面数据板块中没有包含测量活性信息的；在ChEMBL数据库查询3CL靶点数据量在七千条以上，筛选包含IC50活性数据信息的所得记录仅有共117条。查询相关文献如机器学习等训练所用数据量仅有四十条左右。
查阅相关文献综述，3CL靶点的活性小分子化合物抑制剂根据其结构和来源可以分为短肽类抑制剂、有机小分子抑制剂、天然产物抑制剂和金属配合物等。短肽类包括肽乙烯基酯(砜)类抑制剂、肽alpha;-酮酰胺类抑制剂、肽(氮杂)环氧化物类等短肽类抑制剂。有机小分子抑制剂包括吡啶和苯并三唑类、靛红类、吡唑啉酮和嘧啶类、芳香硼酸类、依他尼酸类、杂环酯类、芳香亚甲基酮和氟亚甲基酮类、不对称芳香二硫化物类等。天然产物类包括紫草素、黄芩素、黄酮类化合物如槲皮素、草本素和异白藜芦醇等。金属配合物，尤其是汞和锌的配合物对多种病毒蛋白酶有较强的抑制作用。
根据化合物与3CL蛋白酶催化活性位点的作用模式，抑制剂又可分为共价结合型或非共价结合型。共价结合型抑制剂主要与3CL蛋白酶活性部位Cys145的巯基形成共价键使其失活， 这类抑制剂分子中通常含有一个亲电中心，能够接受S原子的亲核进攻；而非共价结合抑制剂大多为底物竞争型抑制剂，也有少数分子结合在3CL蛋白酶的二聚界面上。
- 前景展望
虽然目前已报道的3CL蛋白酶抑制剂的结构类型比较丰富，但遗憾的是大部分化合物仅有体外酶活水平的数据，少部分在细胞水平表现出抗病毒活性的化合物活性也仅能达到亚微摩尔，仍需进一步的优化改进。其中，抗病毒活性较好、有研究前景的多为共价型肽类抑制剂，其通过与活性部位Cys残基形成共价作用而抑制酶的活力，在广泛应用后病毒可能会很快发生耐药突变，同时肽类化合物本身有不可避免的稳定性差、口服生物利用度低等问题。 因此，具有新作用机制的高活性抑制剂亟需更多的研究。
3CL蛋白酶在溶液中存在单体与二聚体的平衡在催化过程中二聚体为不对称结构，这种动态的结构变化及蛋白质二聚化对于酶催化活性的别构调控为基于结构的抑制剂设计特别是虚拟筛选带来了很大的挑战。目前已发现的针对3CL蛋白酶二聚体结合界面的多肽或分子片段活性均较低，针对3CL蛋白酶从病毒多聚蛋白中成熟过程的抑制剂尚没有报道。此外，3CL蛋白酶的C端非催化结构域功能尚不清楚，提示其在细胞内还有更多的非酶功能有待挖掘。 近期的蛋白质组学研究发现SARS-CoV-2 3CL蛋白酶在细胞内可以与HDAC2发生作用，这种作用对于细胞生长状态以及病毒繁殖的影响都有待进一步研究。随着对于3CL蛋白酶催化活性调控机理、成熟机制及其非酶活性的进一步深入研究，以3CL蛋白酶为靶标的抗冠状病毒药物研发会有更大的突破。
参考文献：
