一、课题解决的问题
肝病是严重危害人类健康的常见病之一, 目前我国的发生率仍保持在较高水平。肝病的致病因素有多种，如病毒感染, 药物损伤, 炎症, 肿瘤等, 肝病的诊断现代医学从实验室检查、及其病理特点或致病原因将肝病分类。由病毒感染引发的肝病为病毒性肝炎，由药物损伤导致称药物性肝炎，而由营养过剩所致则为脂肪肝，胆道蛔虫或结石梗阻诱发的为感染性肝炎、以及原发性或继发性的肝脏肿瘤。其中肝纤维化见于大多数不同病因的慢性肝脏疾病中, 其进一步发展可形成肝硬化, 在临床上常带来严重的并发症，严重影响患者健康与生命。
肝纤维化指肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积, 导致肝脏结构或和功能异常的病理变化。 结构上表现为肝窦毛细血管化和肝刁、叶内以及汇管区纤维化，功能上可以表现为肝功能减退、门静脉高压等。其形成原因主要是肝炎病毒、乙醇、药物与毒物、血吸虫、代谢和遗传、胆汁淤积、自身免疫性肝病等多种损伤因素长期慢性刺激肝脏, 使肝星状细胞活化, 胶原等成分代谢失衡, 生成大于降解, 促使肝脏ECM沉积与组织结构重构。
研究证实，肝星状细胞（HSCs）的激活和增殖是肝纤维化发生、发展的核心环节，它的活化能产生大量的细胞外基质(EMC)。肝星状细胞位于肝窦周围的间隙内,在生理情况下主要参与维生素A 代谢。在各种致肝纤维化因素的作用下，HSCs会从富含维生素A的静息细胞表型激活化为具有增殖性、成纤维性和收缩性的肌成纤维细胞表型，产生大量以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质(ECM)并分泌转化生长因子beta;(TGF2beta;) 、血小板源性生长因子(PDGF) 等各种促纤维化因子,同时产MMPs及其抑制物TIMPs抑制细胞外基质的降解，进一步加重肝纤维化。已有的研究结果表明,H S Cs 激活的为 三级级联反应模式 (l )炎症前期阶段, 肝细胞受损通过释放丝裂原及旁分泌等多种环节促使H S C 活化增殖. (2 )炎症阶段,坏死的肝细胞,炎症细胞被吸收到局部, 活化的K u p fe r 细胞,单核细胞以及血小板释放多种细胞因子促使HSCs转化成MFB , 这些细胞因子包括: 转化生长因子, 血小板源性生长因子 pDGF )及表皮生长因子等. ( 3)炎症后期阶段, MF B 增生合成T G F 一p和PDGF等,通过自分泌和旁分泌促进本身增殖, 继续产生各种ECM成分, 此时, 即使致病因子去除, MFB的自分泌和旁分泌仍可继续进行, 肝纤维化仍可持续发展.
HSCs 的促纤维化肝纤维化是一种可逆性病理改变。抗肝纤维化治疗的近期目标在于抑制肝纤维化进一步发展，远期目标在于逆转肝纤维化, 改善患者的肝脏功能与结构, 延缓肝硬化及其失代偿期的发生, 改善生活质量, 延长患者生存期。治疗肝纤维化的手段也主要以肝星状细胞作为靶细胞。因此，通过抑制炎症反应, 对抗氧化应激, 调节相关细胞因子的活性, 干扰细胞因子信号转导等途径可抑制HSCs 增殖、活化,诱导H SCs 凋亡减少活化HSCs 数量,有利于肝纤维化逆转。鉴于肝星状细胞在肝纤维化形成中的重要作用，以肝星状细胞为靶细胞, 建立体外肝纤维化模型对于筛选新的抗肝纤维化药物具有重要意义。药物细胞筛选模型是基于细胞寻找某种化合物具有药理活性( 生物活性、治疗作用) 的实验方法，它在药物研发过程中是最初过程也是关键步骤。与整体动物模型相比较，细胞分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点，已经成为目前药物筛选的主要方法。由于建立的HSCs细胞系具有与HSCs 相似的形态学及功能特点, 因此可作为进行HSC 基因表达调控、抗纤维化药物作用及肝纤维化发生机制等研究的理想细胞模型。
在构建体外纤维化模型中， 细胞的培养是必不可少的环节。目前动物细胞的培养主要有以下三种方法：1. 贴壁培养法 大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长,并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是:先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 或化学(酶消化法) 的方法分散成细胞悬液,经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中,再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察,适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性,一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制,细胞产量有限。如要继续培养,还需将已形成单层的细胞再分散,稀释后重新接种,然后进行传代培养。
2 悬浮培养 少数动物细胞属于悬浮生长型,这些细胞在离体培养时不需要附着物,悬浮于培养液中即可良好生长,如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后,按一定密度接种于适宜培养液中,置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再分散,只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快,产量高,培养过程简单,是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数少数种类的细胞适于悬浮培养。
3 大规模培养法 动物细胞大规模培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上,融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。 本实验中HSCs的培养将采用贴壁培养。
二、研究方法和技术路线
本实验从大鼠上分离体肝星状细胞，进行体外培养。培养一段时间后向细胞体系加入受试药物。然后用MTT法测定给药后的HSC细胞培养体系，与参照组进行对比。观察给药后HSC细胞有没有出现大量凋亡、生长或活化受到抑制、其产生的胶原，EMC降解或减少的情况，从而判断药物是否对抗肝纤维化有效，筛选出作用良好的药物。
