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理论研究 |
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一、本课题的研究背景 携带金属beta;-内酰胺酶NDM-1（New Delhi matello-beta;-lactamase 1, NDM-1）基因的细菌称为超级细菌，临床上具有超强的耐药性。超级细菌染色体DNA中或游离质粒上的NDM-1基因使细菌产生了广泛的耐药性，其表达的金属beta;-内酰胺酶NDM-1具有多重耐药性。目前研究表明，超级细菌对除替加环素和多粘菌素外的抗生素耐药。特别要关注的是细菌质粒中的NDM-1基因，其不但能垂直遗传给子代，同时具有在不同种类细菌细胞间转移的能力，这种基因结构能够在同种甚至异种细菌之间轻松复制，从而引起临床上越来越多的细菌超级耐药，给细菌性感染相关疾病的治疗带来前所未有的困难[1-4]，同时也对我们研究抗耐药感染药物提出了挑战。临床上，阳性球菌中出现了非常难治的多重耐药菌感染，这种高度耐药的多重耐药阳性球菌除个别抗生素外几乎对所有抗菌药物都耐药，对临床形成了很大的威胁[5]。特别值得一提的是，大量研究结果表明[6-8]，在临床大剂量和长时间使用多种抗生素的情况下，金属beta;-内酰胺酶的基因突变现象不断发生，多重耐药性细菌不断扩散和传播，临床抗生素使用的选择性范围越来越小，这是我们有理由相信，超级细菌携带的金属beta;-内酰胺酶NDM-1耐药基因的突变在所难免，临床超级细菌的蔓延给人类带来重大威胁。 目前，尚未报道可用于临床治疗的、安全有效的抗NDM-1超级细菌感染药物，科学家们正积极开展抗超级细菌药物的基础和应用研究。在新药设计方面提出了一些新的设想，包括：(1) 药物与酶活性中心的金属离子结合，或通过其它方式阻止NDM-1 酶与beta;-内酰胺环结合；(2) 针对NDM-1 的突变基因，利用克隆激活沉默基因或利用诱变剂而设计出新抗生素；(3) 对已有抗生素进行某些基团的改造以阻止NDM-1 酶与beta;-内酰胺类抗生素作用[9]等。但是，这些设想的进一步证实需要一定的时间，科学家警告说，可能10年内都不会出现有对NDM-1有效的新的抗生素出现，并且通过改造已知抗生素的某些基团，可能还是难以克服抗生素耐药性的软肋。 抗菌肽( Antimicrobial peptides) 是宿主免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽类及其衍生物抗菌活性物质[10,11]，广泛存在于植物、昆虫、动物及人体内。阳离子抗菌肽( Cationic antibacterial peptides) 是植物和动物产生的含有12 ～ 50 个氨基酸的阳离子型(含多个赖氨酸和精氨酸) 的两亲性分子。研究发现，阳离子型抗菌肽不仅具有广谱的抗菌活性，同时具有传统抗生素无法比拟的优越性即不会诱导抗药菌株的产生。目前对抗菌肽的研究非常热门，包括理化性质、结构特征、生物活性及分子设计与合成等，因此，阳离子抗菌肽有望成为一类新型的抗菌药物来源。 目前，尚未见关于构建基于金属beta;-内酰胺酶NDM-1超级细菌感染的体内/外模型的相关文章和报道，虽然部分文献中有学者采用NDM-1超级细菌的临床分离株进行体内/外实验，但由于该超级细菌传染性较强，危险性较高；同时，细菌来源不易，菌种保存困难等，造成了研究上的不便，所以，复制安全、有效、通用的NDM-1超级细菌体内/外感染模型可为抗耐药菌活性药物的筛选及药理药效研究奠定基础。 同时，基于金属beta;-内酰胺酶NDM-1抑制剂的抗耐药菌感染药物活性及机理研究在抗超级细菌药物的基础和应用方面具有重要意义。 本实验室设计合成多种具有抗菌活性的多肽，其中包括金环蛇抗菌肽BF-30、以及它的各种结构优化体，如Cbf-16，Cbf-A3A17和Cbf-14等，它们均属于阳离子型抗菌肽。本实验室前期研究已证实，Cbf-16和Cbf-A3A17对NDM-1超级细菌具有良好的体外抗菌活性。但由于其抗菌活力温和，且体内稳定性差等不足，本研究对Cbf-16进行了进一步的结构修饰，得到稳定性提高的新型抗菌肽，并构建NDM-1超级细菌感染的体内模型，评价新型抗菌肽对NDM-1超级细菌的抗菌活力和分子机制。 本实验室前期研究了金环蛇抗菌肽BF-30对临床耐药的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的体内、体外的抗菌活性，并对其抗菌活性进行了探索。研究发现BF-30能够通过损伤细胞膜的方式在体内外发挥强效的抗菌活性，并且不易产生耐药性，为BF-30将来在临床上治疗耐药菌感染性疾病提供良好的实验依据，并对一系列新的具有抗菌活性的化合物的研究具有一定的指导意义[26]。 自超级细菌发现以来，由于其感染性强，严重威胁人类健康，故本实验室通过构建可诱导表达的重组E. coli BL21 (DE3)-NDM-1体系，弥补实验中的安全隐患。已有结果表明：以E. coli BL21 (DE3)-NDM-1为表达体系，成功构建出NDM-1超级细菌的细胞模型，通过替加环素、多粘菌素和本实验室设计合成的多种新型抗菌肽（Cbf-K16、Cbf-A3A17和Cbf-14等）进行细胞模型的验证，初步建立得到了通用的NDM-1超级细菌体外模型 [27]，为该研究课题的开展提供了方法支持。 二、研究内容及实验流程图 （1）以E. coli BL21 (DE3)-NDM-1为研究对象，构建抗NDM-1超级细菌活性物质筛选的动物（小鼠）模型。以ICR小鼠为实验对象，腹腔注射E. coli BL21 (DE3)-NDM-1，并进行IPTG尾静脉注射连续多次诱导，以替加环素、多粘 没菌素和本实验室最新发现的新型抗菌肽（Cbf-K16、Cbf-A3A17）等药物对模型进行验证，逐日观察、记录并计算各项指标，定时取粪便、组织或血液进行细菌计数、细菌基因与蛋白表达及酶活力测定等。 （2）Cbf-16的结构优化，由于Cbf-16的抗菌作用温和，及体内稳定性不好的缺点，对其进行结构改造，将其减少两个氨基酸变成Cbf-14，或通过引入非天然氨基酸构建突变体。通过HPLC考察Cbf-14及其他优化体对胰蛋白酶/胃蛋白酶、过酸过碱环境、温度及血清等影响因素的稳定性。同时，通过测定不同优化体对多种耐药菌株（包括NDM-1超级细菌）的MIC、MBC值， 比较体外抗菌活性，筛选出活性及稳定性最强的抗菌肽。 （3）基于建立成功的NDM-1超级细菌感染的动物模型，评价抗菌肽的体内抗耐药菌活性及机理，在基因、蛋白和酶活性水平阐明其与NDM-1相互作用的分子机制。活性研究包括：MIC、MBC及KCs、动物死亡保护率、组织活菌计数、组织NDM-1表达情况及酶活力测定等。机理研究主要包含对细菌核酸和蛋白质的合成、改变细胞膜的通透性、干扰细胞壁的合成等方面的研究。 实验流程图：
三、本课题拟解决的问题 （1）建立抗NDM-1超级细菌活性物质筛选的体内模型 抗E. coli BL21 (DE3)-NDM-1超级细菌药物的细胞模型和动物模型可应用为通用的体内模型，进而可研究NDM-1临床突变体的耐药特性，建立针对NDM-1基因突变体的药物的体内筛选模型，并进行相关活性化合物的药效和分子机制研究，为抗超级细菌药物的研发奠定基础。 在体内模型构建方面：主要是保证诱导剂在体内的有效诱导浓度和诱导时间，以及诱导剂对机体的安全范围。采用首剂量冲击方法，同时配合连续多次静脉注射诱导，使诱导剂维持在稳态血药浓度水平。 （2）抗NDM-1超级细菌感染药物的活性及分子机制研究 针对抗菌肽Cbf-16、Cbf-14和Cbf-A3A17，基于建立成功的NDM-1体内模型，评价抗菌肽体内外抗耐药菌活性及机理，在基因、蛋白和酶活水平阐明其与NDM-1相互作用的分子机制。活性研究主要包括：动物死亡保护率，组织、血液活菌计数，组织及血液酶活测定和组织HE染色，观察组织器官的病变情况等。机制研究主要包含对细菌核酸和蛋白质的合成、改变细胞膜的通透性、干扰细胞壁的合成等方面的研究。 四、本课题所用方法及其优越性 4.1 研究方法 4.1.1 NDM-1超级细菌感染动物模型的建立及验证 （1）构建NDM-1超级细菌感染的动物（小鼠）模型，主要通过腹腔注射E. coli BL21 (DE3)-NDM-1，并进行IPTG尾静脉注射多次持续诱导；这里主要难点是维持IPTG在体内的有效诱导浓度和持续的诱导时间。 （2）以阳性对照药替加环素、多粘菌素和阴性对照药氨苄青霉素钠、头孢拉定等进行动物模型的验证，从而得到通用的NDM-1超级细菌感染动物模型和方法。 4.1.2 抗菌肽Cbf-16的结构优化及优化体的理化性质测定 （1）以本实验室已经设计合成的抗菌肽Cbf-16为基础，对其进行结构改造，得到以Cbf-14为主的3种结构优化体； （2）通过HPLC考察Cbf-14及其他优化体对胰蛋白酶/胃蛋白酶、过酸过碱环境、温度及血清等影响因素的稳定性。同时，通过测定不同结构改造体对多种耐药菌株（包括NDM-1超级细菌）的MIC、MBC值， 比较体外抗菌活性，筛选出活性及稳定性最强的抗菌肽。 4.1.4 结构优化后抗菌肽对超级细菌体内感染的抗菌活性及机理研究 （1）基于建立成功的NDM-1超级细菌感染的细胞/动物模型，评价抗菌肽的体内抗耐药菌活性。主要测定指标包括：体外：MIC、MBC及KCs等指标；体内：动物的死亡保护率、组织及血液的活菌计数、组织及血液NDM-1酶活力的测定、组织HE染色观察病变情况及治疗效果等； （2）抗菌超级细菌作用机理研究，即在基因、蛋白和酶活性水平阐明其与NDM-1相互作用的分子机制，研究内容主要包含对细菌核酸和蛋白质的合成、改变细胞膜的通透性、干扰细胞壁的合成等方面的研究。 4.1.4实验创新性 有学者了解替加环素及多粘菌素对产NDM-1的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌引起的肺部感染的治疗效果，结果表明，多粘菌素对动物死亡保护率的影响不明显，而替加环素能明显降低动物的死亡率。即，多粘菌素对实验性肺炎的治疗效果不如替加环素好[23]，但也存在某些产NDM-1细菌对这两种药物具有耐药性[24,25]。而国内，目前尚未见报道抗NDM-1超级细菌感染的抗菌肽研究方面的文章。因此，本课题通过构建NDM-1超级细菌感染体内/外模型，就本实验室设计合成的多种新型抗菌肽（如：Cbf-16、Cbf-A3A17和Cbf-14等），筛选它们对NDM-1超级细菌的抗菌活力，并研究相关的抗菌分子机制。因此，该课题是非常切实和具有创新性的。 五、本课题的进度安排 1) 实验前培训；（3.1-3.2） 2) 实验基础操作的学习；（3.3-3.7） 3) 动物基础实验技能的学习；（3.7-3.10） 4) 动物实验模型的建立：（3.13-4.22） A．动物死亡保护率实验（3.13-3.17） B． 组织活菌计数实验（3.13-3.18） C． 组织酶活测定实验（3.18-3.28） D．组织病理学检查试验（3.28-4.12） E． 切片细菌染色实验（4.12-4.22） 5．动物筛选模型的验证（4.22-5.14） 6. 实验结果汇总整理（5.15-5.25） 参考文献： [1] M. 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