开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
选题的意义及研究状况
TNF-alpha;是一种能引起某些肿瘤出血性坏死的细胞因子，一般由激活的巨噬细胞产生。研究发现，肿瘤坏死因子不仅肿瘤杀伤活性较强，还具有其它多种生物效应，包括激活多形核细胞及巨噬细胞、诱导产生多种细胞因子、调节机体免疫、促进表达组织相容性复合物、使机体的抗感染能力增强、在骨组织的吸收和重塑中起重要作用等。但是，肿瘤坏死因子TNF-alpha;的过量表达会造成炎症反应，可致发热、休克、严重者可导致多个器官的衰竭或死亡。TNF-alpha;与很多脏器衰竭、自身免疫病、传染性疾病及某些治疗伴随综合征有关。目前大量科研人员对肿瘤坏死因子alpha;进行了改造，以提高其细胞毒性并降低副作用为目的得到了大量突变体，以期在临床用于肿瘤的治疗。同时，包括肿瘤坏死因子alpha;抗体、可溶性受体在内的拮抗剂已获准上市用于治疗节段性肠炎、类风湿性关节炎等于肿瘤坏死因子alpha;密切相关的疾病。以往要得到较高纯度的蛋白须经多步层析，纯化以非融合标签的形式表达的肿瘤坏死因子alpha;，操作比较繁琐。本实验克隆了人肿瘤坏死因子alpha;基因并以融合标签形式表达，主要以可溶形式表达TNF-alpha;，并可通过一步亲和层析来得到较高纯度的蛋白，对今后肿瘤坏死因子TNF-alpha;的研究和利用有重要意义。
研究目的
从人淋巴细胞中克隆hTNF-alpha;（人肿瘤坏死因子alpha;）基因，通过构建原核表达载体，经过表达及纯化得到具有生物学活性的人肿瘤坏死因子alpha;，为人肿瘤坏死因子alpha;的深入研究和利用奠定基础。
研究方法
利用 RT-PCR 方法从人淋巴细胞中克隆 hTNF-alpha;基因,并分别插入到pGEX-6P-1的GST标签和 pHisSUMO expression的SUMO ( small ubiquitin-like modifier)标签下游构建成重组表达载体pGEX-6P-1-hTNF-alpha;和pHisSUMO-hTNF-alpha;。将两种载体分别转化大肠杆菌Rosetta (DE3), 比较两种载体 hTNF-alpha;表达量及可溶性的差异。选择表达效果较好的重组载体对hTNF-alpha;进行诱导表达,经纯化并切去融合标签后获得成熟hTNF-alpha;蛋白。以L929细胞为靶细胞, 利用MTT比色法检测其细胞毒活性 。
1． hTNF-alpha;基因的克隆及重组表达载体的构建
2． 目的蛋白的诱导表达
