dCas9融合TniQ蛋白的CAST系统功能验证16401229 李延拓Tn7转座子是一种能够在基因组中任意移动的跳跃基因，而CRISPR-Cas系统是细菌防御外源性的DNA元件或者噬菌体入侵的一种免疫机制。
最新研究报道发现在蓝细菌中存在一种Tn7转座子和CRISPR-Cas融合的新系统（CAST系统）[1]，Tn7转座子可利用核酸酶缺陷的CRISPR-Cas系统来催化RNA引导的可移动遗传元件整合到基因组中，精准的将DNA插入PAM下游60-65bp左右的位置，且对于0.5-10kb大小的片段都有较好的插入效率。
该系统包含TnsB，TnsC，TniQ和Cas12k四个蛋白，Cas12k和gRNA形成的复合物只能识别相应的DNA序列但不切割DNA。
文献表明，dCas9融合睡美人转座子蛋白能够提高该转座子的定向插入功能[2]。
为提升CAST系统的应用价值及范围，本课题拟选择dCas9与TniQ融合的方法，研究dCas9融合TniQ蛋白的CAST系统能否进行基因片段的定点插入及能插入的片段范围。
CRISPR系统是原核生物体内由RNA介导的序列特异性识别外源核酸，并通过核酸内切酶对其进行切割的获得性免疫系统。
CRISPR系统对目的位点造成的DNA双链断裂(double-strand break, DSB)可以分别利用非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)或者同源介导的双链DNA修复（homology directed repair, HDR）对目的位点进行编辑，能够实现基因的敲出，敲入或者点突变等精确的基因编辑，但是同源重组较低的效率和DSB引起染色体易位、重排等风险阻碍了基因编辑技术在疾病治疗中的应用[5]。
2016年David Liu研究组开发的BE3系统首次提出可以不切断DNA双链的前提下进行精确的基因编辑获得广泛的关注和应用。
但该系统仅能够进行单碱基编辑，开发一个无需DSB便能将外源DNA片段定向插入的工具一直基因编辑领域突破的热点。
