- 文献综述（或调研报告）：
肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。
世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）于2018年9月发布了2018年最新全球癌症统计数据《全球癌症报告》，提供了全球185个国家和地区36种癌症的发病率、死亡率等相关数据。其中2018年约有84万人将被新诊断为肝癌，又有78.2万人死于肝癌。从死亡病例数字来看，肝癌排在第四位，占总数的8.2%。肝癌中的75%～85%是肝细胞癌（HCC），这种癌症与乙肝病毒（HBV）的感染密切相关。而中国的肝癌高发则正是与之相关[1,2]。
原发性肝癌早期一般无任何临床症状，多发现和诊断于中晚期，因此预后极差。早期发现是提高肝癌五年生存率的最佳途径之一。
胞外囊泡携带许多分子，例如蛋白、多肽、RNA、脂质和DNA片段等，从供体到受体细胞，在肿瘤微环境中引发了相对显著的表型变化。新兴证据表明，胞外囊泡在癌症发展中发挥着至关重要的作用。现在公认癌细胞比非恶性肿瘤细胞分泌更多的胞外囊泡，并且这些微粒可以从体液中分离出来。因此，胞外囊泡具有作为基于血液或尿液中的生物标志物的巨大潜力，可用于诊断，预后和癌症监测[3]。
从胞外囊泡中的蛋白质组学分析、寻找蛋白标志物入手进行肝癌早期诊断的研究，是因为一项研究表明，将来自相同肿瘤样本的基因组学分析结果和蛋白质组学分析结果相结合对比，蛋白质组学中包含了仅通过基因组学分析无法分辨出的新信息，这也正是基于肿瘤基因组图谱的预测疗法对许多患者没有作用的可能原因[4]。并且可作为生物标记的生物分子中，核酸在体液中容易被降解，代谢物在体内处于剧烈的动态变化，使得这两种生物分子在临床的运用受到限制。相比之下，蛋白质更加适合作为疾病的生物标志物，也因此目前的大部分有效生物标志物是蛋白质。
外泌体中的特有蛋白，如四次跨膜蛋白CD63、CD9，肿瘤易感基因相关蛋白Alix等。这些蛋白不但参与泡体的形成和细胞内多泡体转运，是鉴定外泌体的标志物，而且还介导诸多肿瘤生物学功能[5-9]。已有实验证实四次跨膜蛋白CD63、CD9可与整合素、生长因子及其受体结合形成复合体，从而依赖于钙粘附蛋白的作用，导致细胞极性改变，调控细胞的移行，从而影响肝癌的发生发展。Alix即ALG-2相互作用蛋白X，是转运必需内体分选复合物Ⅲ的组成部分，参与受体内吞以及细胞粘附和趋化等细胞行为，与细胞凋亡途径相关。Park等发现细胞在缺氧微环境中可以分泌外泌体刺激血管形成，携带的跨膜蛋白和Alix蛋白增加转移潜能，为肿瘤的发生与转移提供更有利条件[10]。还有课题组研究发现，HCC患者外周血中存在SMAD3蛋白丰富的外泌体，其水平与原发肿瘤的疾病分期和SMAD3表达有关。HCC细胞以paracrinal/endocrinal方式促进癌细胞增殖和肺转移形成，该HCC衍生的外泌体中SMAD3蛋白介导了这种现象，增强细胞粘附来促进肿瘤转移[11]。因此，通过对肝癌细胞外泌体蛋白的研究，有利于更好揭示肝癌发生发展的机制。
研究外泌体的蛋白组学最大限度地减小了体液中高丰度蛋白质的影响，并富集了可能是潜在疾病生物标志物的低丰度蛋白质。各种各样的外泌体分离方法，包括超速离心、免疫亲和珠粒、超滤等，被用于基于高通量质谱的哺乳动物细胞外泌体的蛋白质组分析，曾经，最常用的分离方法是超速离心法，通过0.1 - 0.2微米过滤或不过滤的差速离心，可以预清除细胞、细胞碎片和大的凋亡小体，然后再进行超速离心或蔗糖缓冲超速离心分离出来哺乳动物外泌体[12]。目前，应用最多、研究最多的细胞器、蛋白质等生物分子分离方法是蔗糖浓度梯度/超速离心法，就是同时使用蔗糖浓度梯度和超速离心对外泌体进行分离。蔗糖密度梯度超速离心法基于外泌体的大小和密度。这种方法已被用于从条件培养基、体液和组织中分离外泌体。超速离心法的差速离心不仅会沉积外泌体。还会有其他细胞外囊泡和蛋白碎片，这是导致其结果不理想和产量相对较低的原因[13]。因此，使用蔗糖密度梯度作为超速离心法的延续，可以在需要额外纯度时更好地分离外泌体颗粒[14] 。
由于外泌体通常是少量分离的，因此需要利用更高灵敏度的方法来对它进行分析。相较Western blot和ELISA是在相对较窄的范围内对目标蛋白进行定量，质谱则能够实现高通量大规模的肽谱分析[15]。其中，液相色谱(纳米级或超高性能)电喷雾串联质谱(LC/ESI-MS/MS)是研究外泌体蛋白质最广泛使用的分析技术，提供了高灵敏度和分辨率，允许从单个样品中检测、识别、表征并定量成千上万的蛋白质。
一项研究显示，采集对照小鼠和肝癌类器官受体小鼠的全血，分离纯化得到二者的胞外囊泡后，通过Easy nLC 1000液相色谱和Velos Pro LTQ-Orbitrap质谱仪进行蛋白质组学分析，得到的结果为肝癌类器官受体小鼠胞外囊泡中含量最高的前50个蛋白中，有多种已知的促进多种肿瘤转移的蛋白，如分泌性磷蛋白1、粘蛋白13、表皮生长因子受体激酶底物8等已确定。在这些蛋白中，只有分泌型磷蛋白1以前被认为是肝癌检测的血清生物标志物[16]。
除了上述的全蛋白样品分析之外，由于蛋白质翻译后修饰（PTM）的状态（例如磷酸化和糖基化）可能是细胞生理学的关键决定因素，蛋白质中PTMs的改变被认为是癌症和神经变性等疾病早期发生和发展的主要决定因素，因此胞外囊泡中蛋白质PTM的全面表征对于早期诊断和疾病状态监测也非常有价值。但是，由于纯化的胞外囊泡数量有限，PTM蛋白含量低以及生物流体中蛋白质和代谢产物的干扰，胞外囊泡中PTM的分析非常复杂。由于在例如血浆等高度复杂的临床相关样品中研究低丰度胞外囊泡PTMs的工具的有限性，这些靶点在很大程度上尚未被探索出来。质谱是用于研究PTMs的主要工具，多种基于质谱的方案被引入到蛋白质组范围内进行有效的分析PTMs。近日，一个团队开发出了一种从少量的人体血浆中分离胞外囊泡中磷酸蛋白和糖蛋白的方法，使得能够鉴定出近10000种独特的磷酸肽和1500种独特的N-糖肽。该方法证明了利用这些数据识别潜在的标志物来区分疾病和健康状态的可行性[17]。
