一、课题的研究背景、意义和目的
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）简称肺炎球菌，为革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，多呈双球或短链状排列，宽端相对，尖端相背。肺炎链球菌在正常人的口腔及鼻咽部经常存在，一般不致病，只形成带菌状态，只有在宿主免疫力下降时才进一步侵染致病。肺炎链球菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎等疾病 (Kostyukova et al., 1995)，每年在全球约造成100万儿童死亡。在肺炎链球菌致病过程中，位于细胞壁外的荚膜多糖起重要作用，是其最主要的毒力因子。荚膜的毒力作用在于它的抗吞噬活性 (Jonsson, et al., 1985)，同时它对于细菌定殖也很重要，可以防止细菌被粘液机械清除，同时也可以限制细菌自噬和减少细菌被抗生素攻击 (van der Poll amp; Opal, 2009)。
随着基因组学的发展，在过去30多年的研究中，人们发现荚膜主要有三种合成途径：Wzy依赖途径、ABC转运蛋白依赖途径和合酶依赖途径。其中，大部分血清型的肺炎链球菌都采用Wzy途径合成荚膜多糖。Wzy依赖途径合成多糖包括五个步骤：起始、延伸、翻转、聚合和定位。(1) 起始：在肺炎链球菌中，荚膜合成的起始是通过可逆的将葡萄糖-1-磷酸从UDP-糖中转移到十一烷基磷酸脂质（Und-P）第55位碳的磷酸基团上的一个羟基上。这个过程是由CpsE催化的。CpsE在荚膜合成中扮演起始者的角色，是一个比较保守的跨膜蛋白；(2) 延伸：荚膜合成起始后，接着会由位于荚膜基因座上其他基因编码的糖基转移酶依次催化糖基添加上去，以合成多糖的基本重复单位。这些糖基转移酶可能以多酶复合体的形式存在，使得酶活性得以提高；(3) 翻转：重复单位合成后，会在翻转酶Wzx的催化下，从胞内翻转到胞外；(4) 聚合：翻转至胞外的多糖重复单位，会在聚合酶Wzy的作用下，进行重复单位间的聚合，但因Wzy聚合酶有特异性，所以多糖产物的长度和分支会具有菌种差异性 ；(5) 定位：聚合产物的最终定位机制目前还不清楚，但产物的去向已有鉴定，主要有三种方向：一是当即被释放出胞外，二是会与细菌胞外的肽聚糖相连，三是会连在膜上，通过与膜上成分相连接而固定。
目前，尽管多价肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌结合疫苗被广泛使用，但它们的应用仍然有较多的局限性。并且已有肺炎链球菌对青霉素和大环内酯类抗生素产生耐药性，甚至同时具有多重耐药性 (Erdem amp; Pahsa, 2005; Richter et al., 2002)。因此找寻新的疫苗或药物靶标迫在眉睫。荚膜多糖对于肺炎链球菌的致病具有重要作用，而作为起始糖基转移酶的CpsE对荚膜多糖的合成尤为重要，因此我们希望通过研究CpsE的结构和功能，为设计抑制剂抵抗肺炎链球菌感染奠定理论基础。
- 课题研究的主要内容
1. CpsE重组质粒的构建
设计引物从肺炎链球菌基因组中扩增出目的基因，再用重组法将目的片段插入到载体pET28a上，涂板挑取阳性单克隆，进行菌液PCR验证后送测序。
2、CpsE重组蛋白的表达检测
将重组质粒分别转化到不同的大肠杆菌表达菌株中，收菌、破碎和离心后用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证重组蛋白的表达情况。选择最佳表达菌株和诱导温度以进行大量培养。
3、CpsE重组蛋白的纯化
使用合适的条件进行大量培养，然后使用镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化目的蛋白。
