开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、研究背景及意义：
内质网和线粒体是生物细胞的常见细胞器。线粒体是真核细胞的重要细胞器, 也是能量产生的主要场所。三大营养物质:糖、脂肪、蛋白质在三羧酸循环中脱下的 H , 通过线粒体内膜上一系列呼吸酶复合物组成的呼吸链的逐级传递, 最终与氧结合生成水。在电子传递过程中所释放的能量不断地将线粒体基质中的 H 逆浓度梯度泵出线粒体内膜, 形成一质子跨膜梯度, 即线粒体跨膜电位 ( mitochondrial transmembrane potential, ) , 由此将电子传递过程中产生的化学能转变为跨膜电势能, 为ADP 磷酸化生成 AT P提供能量[1]。线粒体膜电位不仅有利于维持线粒体内环境的稳定, 而且为 ATP 生成直接提供能量, 故为反映线粒体功能的敏感指标[2]。线粒体也是脂肪酸氧化降解的主要场所，当过量的脂肪酸进入线粒体，势必产生大量的递氢体参与呼吸链电子传递，破坏线粒体的氧化还原平衡,造成线粒体能量生成障碍，与此同时，引起细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量产生[3]。ROS 是生物体内的氧自由基，包括氧和含氧的高反应活性分子(如超氧化物阴离子、组织过氧化物和自由基等)，主要来源于线粒体[4]。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞加工蛋白质和贮存Ca2 的主要场所，真核细胞的膜蛋白及分泌性蛋白是在内质网（ER）中合成后，经过翻译后修饰、折叠和组装，由高尔基体进一步加工后转运到膜上或分泌到细胞外。内质网与线粒体信号通路之间存在串扰, 内质网 In-sp3/Ca2 通道的开放影响线粒体钙离子的平衡, 线粒体钙离子平衡紊乱会导致线粒体膜电位、通透性转换孔及其他发生改变[5]。线粒体活性与内皮功能密切相关，当线粒体裂分过度时会引起线粒体膜电位损伤，既而启动线粒体途径细胞凋亡程序，导致细胞凋亡，最终引发内皮组织功能紊乱。
氧化应激、内质网应激参与调节线粒体功能。在各种因素作用下新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰，将引起未折叠蛋白在ER中堆积，使细胞产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS) [6]，内质网应激常导致内质网内未折叠蛋白质或错误折叠蛋白的蓄积，引起未折叠蛋白反应（UPR），其下游PERK，IRE-1alpha;，ATF6是内质网应激的三条信号通路的重要分子，这三个分子存在于内质网膜上，是感受腔内为折叠蛋白堆积，并将内质网应激的刺激信号放大[7]。内质网中蛋白质的折叠反应中会产生活性氧，因此大量出现的蛋白质会伴随大量的活性氧的产生。大量的活性氧聚集在内质网腔中引起内质网中贮存的钙离子释放入胞浆，可引起线粒体的膜电位降低, 触发线粒体 MPTP孔开放引起级联反应, 产生大量活性氧。活性氧启动钙从内质网钙池的释放, 导致线粒体内钙积聚, 这进一步增加了活性氧的产生, 放大氧化应激及钙超负载, 引发恶性循环。ROS本身还可使线粒体膜脂质过氧化、膜流动性降低、线粒体膜通透性升高[8]，导致线粒体膜电位丧失，膜外翻，功能受损，细胞色素c释放入胞质，最终启动caspase级联反应，其中caspase-3是最终执行凋亡的关键分子。caspase-12 属于半胱天冬酶家族，生理情况下以无活性的酶原形式定位于内质网膜上。当 ERS 发生时，caspase-12 酶原被切割活化，释放到胞质中，激活caspase-9 进而激活死亡执行半胱天冬酶 caspase-3 诱导细胞凋亡。caspase-12途径是 ERS 特有的途径，常被用来检测 ERS 诱导的细胞凋亡[9]。
腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种异源三聚体蛋白, 由3个亚单位组成，是细胞内能量代谢的调节器，在对抗外界应激维持细胞稳态中发挥重要作用[10][11]。在肌肉和肝脏中, AMPK 的活化增强了葡萄糖的摄取、脂肪酸氧化作用和胰岛素敏感性, 并且减少了葡萄糖、胆固醇和甘油三酯的产生[12]。AMPK在保护血管稳态起着多种保护作用，包括调节细胞存活和抑制炎症及氧化应激。此外，AMPK表现出通过抑制内质网应激改善血管功能的作用[13][14]。这些现象显示了AMPK激活可以通过抑制内质网应激相关的炎症来改善内皮功能。已有实验表明其可以抑制高糖引起的血管内皮细胞中caspase-3的活性，减少细胞凋亡；激活AMPK可抑制ACC的功能，促进内皮细胞对FFA的氧化，拮抗FFA造成的内皮细胞脂毒性；抑制ROS和NF-kappa;B的活性以及炎性因子的生成。内皮中的AMPK还可以通过磷酸化丝氨酸1177位点，激活一氧化氮合酶，增强内皮依赖性的血管舒张。内皮依赖性舒张功能是评价血管功能的重要指标，由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）合成的一氧化氮（NO）通过促进血管内皮舒张及抑制炎症来发挥维持血管稳态的作用。线粒体活性与内皮功能密切相关，当线粒体裂分过度时会引起线粒体膜电位损伤，既而启动线粒体途径细胞凋亡程序，导致细胞凋亡，最终引发内皮组织功能紊乱。
线粒体功能障碍与氧化应激密切相关,因为线粒体不仅是活性氧产生的主要部位, 而且还是活性氧攻击的主要靶点[15]。调控线粒体生物合成、提高线粒体功能的机制虽然还没有完全清楚，有待进一步研究，但是，线粒体功能损伤有可能在代谢类疾病和心血管类疾病的发病中起着重要的作用（罗格列酮对 2 型糖尿病大鼠肝脏线粒体功能障碍的影响），有研究报道AMPK改善内皮功能与其抗氧化活性有关，AMPK亦可改善线粒体功能，但是直接作用还是间接作用有待研究。因此，本课题拟采用棕榈酸刺激内皮细胞，检测线粒体结构及功能的变化，研究引起内皮细胞功能紊乱的具体机制，寻找药理活性AMPK激动剂改善线粒体功能的关键靶点。
- 实验设计
1.采用的手段及方法：
⑴ 采用棕榈酸PA刺激内皮细胞造ERS模型，并检测其下游PERK，IRE-1，ATF6等重要分子磷酸化水平是否升高，判定造模是否成功，给予药物干预观察有无效果。
⑵ 检测空白对照组、模型组、药物组、阳性对照组中细胞质ROS和线粒体途径ROS的含量变化。
⑶ 检测p-AMPK、p-DRP1(Ser637)在空白组、模型组、药物组与阳性对照组表达量。
