一、简介
基因治疗是指将治疗基因、正常基因等外源性遗传物质以某种方式导入靶细胞，以此来纠正基因缺陷或者病变，阻遏致病基因的表达，从而对先天遗传性疾病以及后天获得性疾病起到治疗作用的一种分子生物学技术。近年来，随着分子生物学等学科的发展，基因治疗已经成为当前的研究热点，并且取得了较多的进展。
设计和构建安全有效的基因载体是基因治疗的关键环节，其必要性体现在如下三点：1.裸露的基因在递送过程中极易受血清和胞内核酸酶的降解作用，从而无法发挥治疗效果；2.基因带有大量负电荷，细胞膜表面同样带有负电，由于电性相同，基因难以跨膜入胞；3.质粒等遗传物质粒径较大，难以通过内吞作用摄取。因此合理设计载体用来压缩并保护基因对于基因递送的有效性至关重要。
目前常用的基因载体包括病毒载体和非病毒载体，然而由于病毒载体存在毒性高、免疫原性、递送基因量有限等问题，其应用受到限制。相较而言，非病毒载体更安全，而且有着简单经济、易于修饰等优点，具有更大的研发潜能。非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，其中阳离子聚合物由于使用限制较少而广泛应用。
聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）是一种最为常见的阳离子聚合物基因载体，分子量为25KDa的支链型PEI则被视为阳离子聚合物基因转染的黄金标准。其高转染率主要得益于“质子海绵”效应，使之具有溶酶体逃逸能力。PEI和基因可以通过静电作用形成带正电的基因复合物，从而屏蔽基因负电荷并且起到压缩基因的作用。基因复合物通过内吞作用入胞形成内涵体，之后内涵体形成溶酶体。由于PEI含有大量可质子化的氨基，质子泵持续提供质子进入封闭溶酶体内与之结合，从而引发氯离子内流进入溶酶体内中和多余的电荷；此时，溶酶体内部的渗透压增大，可吸收大量水，从而胀破溶酶体，最终使复合物及时逃逸进入细胞质。这种复合物从内涵体逃逸的机制被称为“质子海绵”效应。另外，阳离子聚合物对于溶酶体内的酸性环境具有缓冲能力，能保护其携带的基因不被溶酶体中的酶破坏。尽管大分子量PEI具有很高的基因转染率，但却因降解性差引起严重的细胞毒性而存在安全隐患；而小分子量PEI毒性虽小，但因基因压缩能力有限而使得转染率偏低（1）。基于大分子量PEI转染率高、降解性差而小分子量PEI降解性好、转染效率低的问题，本课题拟采用非共价键交联法将小分子量PEI交联成大分子量PEI，从而在保证基因载体安全性和转染有效性的同时，兼顾递送稳定性与基因速释放性，期待实现基因的高效递送。
- 研究概况
PEI修饰分为高分子量和低分子量PEI修饰。高分子量修饰主要通过接枝PEG来屏蔽PEI的大量正电荷，以减少PEI毒性，然而这种方法不利于细胞内吞且会使转染效率降低。低分子量PEI本身毒性小，为提高其转染效率，可以采用以下方法：低分子量PEI接枝糖类化合物，疏水性小分子修饰，使小分子量PEI交联键合等。上述方法均可以提高PEI压缩基因的能力、提高生物相容性。此外也有文献报道，PEI可以修饰靶向分子例如叶酸、转铁蛋白等，实现靶向基因递送(2)。
环糊精是一种天然高分子，在体内有良好的生物相容性、低免疫原性，对人体毒性小，有很大的应用价值。苯硼酸是一种两亲性物质，亲水性苯硼酸可以与多羟基糖形成可逆的硼酸键，该结构容易被另一种与PBA结合能力更强的多羟基物质置换。细胞中的ATP具有顺式二羟基结构，与PBA结合能力强，置换能力强。因此，PBA有ATP响应性，常用于ATP响应型载体的构建(3)。本实验拟分别在小分子量PEI上修饰环糊精和苯硼酸，并利用环糊精与苯硼酸间的主客作用力将小分子量PEI聚合物交联起来，使PEI聚合物在细胞内高浓度ATP作用下实现基因的快速释放。
- 研究目的
虽然小分子量PEI毒性低，但其基因转染效率低。所以基于小分子量PEI，本实验目的在于在低毒性的基础上提高其压缩基因的能力，提高转基因效率。本实验首先是通过环糊精接枝低分子量PEI，环糊精类对人体毒性小，通过环糊精修饰，可以增加基因载体的吸收、生物相容性以及保护基因不被核酸酶破坏。除此之外，很多阳离子聚合物载体不可在体内降解，容易堆积引起毒性。用该种方法能够构造可降解的基因载体(4)。另外，再用两亲性小分子苯硼酸修饰低分子量PEI(5)。最后，通过环糊精与苯硼酸间的主客作用力将小分子量PEI交联起来有望获得ATP响应型基因聚合物，同时上述两种方法制备的PEI/DNA复合物进入细胞后，都可以通过质子海绵效应释放，达到了质子响应的目的。
综上，本实验通过以上方法，提高低分子量PEI转染效率，构建智能、低毒、可生物降解的基因载体。
- 研究思路
- 环糊精和PEI接枝共聚物的构建
alpha;-环糊精（alpha;-CD）是一种水溶性好而且低毒的多羟基化合物，低分子量PEI是一种多氨基化合物，氨基和羟基之间可以通过羰基二咪唑（CDI）形成体内可降解的酯键，形成可降解的低毒化合物。
