开题报告内容：
一、课题背景
血脑屏障（ BBB）主要是指由脑血管内皮细胞紧密连接和胶质细胞构成的机械屏障以及由脑药物外排系统和代谢酶构成主动屏障。血脑屏障精密控制血液与脑组织的物质交换,对维持脑内微环境的稳定至关重要。血脑屏障是脑内的毛细血管内皮细胞彼此紧密相连,同时与周围的周细胞和星形胶质细胞相互作用形成的屏障系统。组成血脑屏障的细胞通过表达紧密和黏附连接蛋白、转运体、及相关信号分子,调节血脑屏障的发育和功能。神经元和小胶质细胞在生理和病理状态下也参与血脑屏障的功能调节。BBB 的主要功能是限制多种物质进入脑内，确保脑内环境的相对稳定。多种因素如肝损伤和感染等，可以通过不同的方式影响BBB的功能，使一些本来难以透过 BBB 的物质进入脑内，脑内物质平衡被打乱，导致相应的中枢神经系统并发症发生。前期研究表明急性肝损伤条件下，大鼠BBB上外排转运体的表达与功能都有所改变，但对于门体分流造成的肝性脑病与BBB上外排转运体的研究较少，故本研究在门静脉高压后形成侧枝循环导致的门体分流中，大鼠脑BBB上p-gp和bcrp等外排转运体及通透性的改变情况。
- 要解决的问题
前人研究显示，在门体分流和门静脉高压大鼠中血氨升高，同时认知功能与运动功能损伤，即神经功能发生障碍[1]。并且有研究显示在门体分流大鼠中，细胞外谷氨酸水平的升高使神经传递功能发生改变，进而导致运动功能减退[2]。故门体分流模型可以作为研究肝性脑病的模型之一。本研究以门静脉高压为门体分流脑病模型，考察2周门静脉高压对大鼠BBB通透性和外排转运体的功能与表达的改变影响。
三.可行性分析
门静脉高压7天后就有侧枝循环形成，造成门体分流，肠上产生的氨可部分通过肝进行代谢，而另一部分则可以随着侧枝循环进入体循环，从而通过BBB进入大脑，使得脑内氨累积，造成轻微性肝性脑病。同理，肠上产生的其他毒性物质如内毒素或者来自环境中的毒素刺激着大脑的血脑屏障，打破血脑屏障，使得原本难以进入脑中的药物进入脑内。而也有文献报道门静脉高压模型2周后血氨升高，故本研究采取门静脉高压模型来研究无肝损伤的大鼠BBB上的转运体功能是否会发生改变。.研究结果显示,不同原因引起的肝损伤对BBB上ABC转运体功能与表达影响是不同的,且存在ABC种类差异性.在硫代乙酰胺(TAA)诱导的急性和慢性肝损伤大鼠中,分别罗丹明123(Rho 123)和长春新碱(VCR)在海马和皮层中浓度与血浆中药物浓度比表征P-GP功能,用溴磺酞钠(BSP)和S-(2,4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(DNP-SG)在海马和皮层中浓度与血浆中浓度比表征Mrp2功能.结果显示TAA-诱导的慢性和急性肝损伤均显著增加大鼠海马和皮层中Rho123和VCR浓度与血浆浓度比值,提示BBB中P-GP功能受损.相反显著降低脑组织中BSP和DNP-SG浓度与血浆浓度比值,说明Mrp2功能上调.Western blot结果表明,TAA-诱导的肝损伤显著下调脑内P-GP的蛋白水平,而上调脑内Mrp2的蛋白水平,即TAA-诱导的肝损伤对BBB上P-GP和Mrp2的功能与表达改变是相反的,下调P-GP的功能与表达,而上调Mrp2的功能与表达.高血氨往往是肝性脑病的特征,为此,我们利用腹腔注射醋酸铵诱导高血氨模型,分析高血氨对BBB上P-GP和Mrp2功能与表达影响.结果显示高血氨显著增加BBB的P-GP和Mrp2功能与表达,伴随NF-kappa;B p65水平增加.用大鼠脑血管内皮细胞(rBMECs)
- 研究方法和内容
1、大鼠门静脉高压模型的建立
大鼠门静脉高压模型参照文献【3】：动物适应性饲养一周后，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，在大鼠腹部正中开口4cm，找到门静脉后，在门静脉旁平行放置一根21G钝头针，后用4-0丝线将钝头针和门静脉结扎，最后移开钝头针，观察十二指肠的颜色，应该由紫变粉。对照组为假手术组，开腹后将门静脉游离后关腹。方法:用各种型号钝头直针作门静脉部分结扎.结果:假手术组,用18号、20号钝头直针组,直到术后第5天仍无门脉高压形成.用14号、16号钝头直针组,术后门脉压力均升高,但14号钝头直针组大鼠术后表现明显拒食、精神萎靡、体重减轻、腹水形成并相继死亡.16号钝头直针组,术后0 5小时门脉压力即显著升高,72小时形成稳定的门脉高压.结论:Wistar大鼠门静脉部分结扎致门脉高压动物模型,16号钝头直针外径大小最合适,制模既能成功,又无动物死亡,术后各方面情况均与假手术动物相似.
2、考察门静脉大鼠BBB通透性以及转运体p-gp、bcrp功能改变情况
造模2周后，给予手术组与假手术组大鼠p-gp、bcrp底物及通透性指示剂：0.2mg/kg Rho123、 1mg/kg盐酸哌唑嗪以及2mg/kg荧光素钠静脉注射45min后，脱颈处死大鼠，取血取脑、肝、脾、十二指肠后，测血与脑中三个药物的浓度，来表征转运体功能的改变以及通透性的改变。
