- 课题背景
Sam68是细胞有丝分裂期Src酪蛋白激酶的靶蛋白，分子量为68 kD，故命名为Sam68。作为一种衔接蛋白，Sam68富含6个脯氨酸富集区，被精氨酸甲基化转移酶甲基化后，由胞核穿梭至胞浆可与mRNA结合，维持其稳定性。Sam68参与细胞周期的调控,它通过影响细胞增殖和凋亡,与细胞的恶性转化高度相关，在真核生物中具有十分重要的生物学功能。类泛素化是指小分子泛素样修饰体，可以通过与泛素串联的酶联反应将泛素样修饰体连接到特定的靶蛋白的赖氨酸残基上，如泛素样蛋白NEDD8对蛋白的修饰作用。在类似泛素化的反应过程中，NEDD8通过共价修饰与底物结合，这个过程由三个酶核心的连续级联酶促反应组成，所需要的酶包括NEDD8活化酶（E1）、NEDD8结合酶(E2)、NEDD8连接酶（E3）等。体内泛素化系统是通过将目的蛋白泛素化使其在蛋白酶体降解，进而发挥对细胞产生的生理作用。但是类泛素化修饰的蛋白质不像泛素化的蛋白质那样能被蛋白酶体降解影响底物蛋白的稳定性。类泛素蛋白的翻译后修饰已经被证实参与几乎所有细胞内的调控过程，主要体现在调节蛋白质之间的相互作用、调节转录因子的活性以及拮抗泛素化等方面，同时在细胞周期、信号传导、免疫识别、细胞凋亡、细胞增殖与分化、蛋白质转运、器官起源、炎症、抗原呈递、内质网调控、DNA 修复以及应激反应中也发挥着重要作用。
近来各种类泛素的修饰蛋白被不断发现，如 SUMO (small ubiquitin-related modifier)、NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8)、Atg8(autophagy gene 8)和 Atg12 等，类泛素化研究不断取得重大进展，但对于Sam68蛋白类泛素化研究并不系统而全面，仍有许多的问题有待解决。例如，反应体系中的酶与底物还在不断被发现，其生物学功能也在不断被阐明。有报道发现Sam68与疾病的发生密切相关，并且由于Sam68蛋白表达异常是肿瘤发生发展过程中的一个重要因素,因此已成为肿瘤发病机制研究领域的新热点。本课题研究在体外Sam68 蛋白与底物结合后是否会发生修饰作用，随后会进一步在细胞水平研究Sam68蛋白的修饰对细胞活动的调节功能，进一步探讨翻译修饰后的动态平衡与交互关系，有利于为新药的研究提供理论基础。
Er 二、要解决的问题
根据理论背景及意义，对该课题《Sam68蛋白的体外类泛素化修饰研究》，主要应集中于两个方面：（1）获得Sam68蛋白。如何获得高纯度的Sam68蛋白，是此次实验所需要解决的首要问题。首先是应用基因工程，从特定的生物基因组或cDNA 文库中采用各种方法分离和扩增出足够量的编码Sam68蛋白的基因；根据需要选择合适的载体，经体外操作将目的基因插入载体的多克隆位点上，构建成重组DNA分子；将重组DNA转入大肠杆菌表达载体，使之复制扩增；根据载体上的所携带的选择性标记对重组子进行筛选和鉴定；采用多种生化和分子生物学实验方法对表达的Sam68蛋白进行结构和生物活性分析，以确认表达产物的结构和功能的正确性；通过基因工程菌的大规模培养即可获得大量表达的产物即Sam68蛋白；最后，将表达产物分离纯化，以得到大量符合相应纯度要求的Sam68蛋白。（2）在体外研究Sam68是否可以发生类泛素化修饰。应用SDS-PAGE电泳,BCA比色法，蛋白质印迹(Western blotting)等技术手段,确定修饰后蛋白的分子量等信息，以便确定Sam68蛋白是否可以在体外发生类泛素化的修饰。
三、可行性分析
由于Sam68蛋白是由相应的基因编码经转录为mRNA 而后翻译产生的蛋白，故为获得Sam68蛋白则首先获得编码Sam68的基因，基因克隆的方法很多，目前应用较多的基本方法主要有：①基因文库（基因组文库和cDNA文库）的建立与筛选；②通过聚合酶链式反应（PCR）方法得到；③通过人工化学合成方法制备此步骤可通过从特定的生物基因组中获取。 由于目的基因自身不能复制，必须与载体DNA分子重组后才能进入宿主细胞并复制扩增和表达，从而获得大量的目的基因克隆以及表达产物。此步可通过质粒等载体经限制性内切酶后与目的基因重组，转入宿主细胞克隆。为从大量的宿主细胞群体中筛选出所需的阳性重组子，可根据蛋白表达载体所带有的具体抗生素抗性如AMP 、kan 等抗性，筛选重组蛋白表达宿主菌。经过培养扩增，可获得大量产生Sam68 蛋白的工程菌，经破菌、离心后得到蛋白质的粗提取液。由于本次实验所选用表达质粒可以Sam68蛋白的N末端融合表达6xHis的标签，His标签可以和Ni-NTA结合，杂志蛋白流穿。在高浓度的咪唑缓冲液下可以和重组Sam68竞争性结合Ni-NTA，从而使重组蛋白从Ni-NTA洗脱，即可获得纯度相对高的Sam68蛋白。应用SDS-PAGE电泳技术可分离纯化蛋白并且可以初步测定Sam68蛋白纯度。在体外适宜的缓冲溶液下，加入Mg、ATP等辅助因子，在E1、E2、E3的作用下，Sam68有可能发生类泛素化的修饰。修饰后的样品 通过蛋白质印迹技术(Western-blotting)，可通过此方法检测蛋白水平的表达并分析Sam68蛋白在体外类泛素化修饰研究。
四、研究方法和内容
运用基因工程，微生物学，生物化学等的技术手段和分析方法，完成对Sam68蛋白的体外类泛素化修饰研究。研究内容主要包括以下四方面：
1.基因表达载体的构建
编码Sam68蛋白的目的基因与载体DNA在限制性核酸内切酶作用下产生相同的粘性末端或平末端，经过T4 DNA连接酶的“缝合”作用，将目的基因与载体DNA连接起来，并转入相应的宿主细胞后实现目的基因的克隆与表达。
