开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
基于新型MOAC与ZIC-HILIC磷酸化肽段和完整糖肽富集原理的双功能磁性介孔材料的制备及性能研究
蛋白质磷酸化、糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰之一，在免疫保护、信号转导、蛋白质翻译调控、蛋白质降解、细胞壁合成等生物过程中均发挥着至关重要的作用。然而，蛋白质磷酸化的可逆动力学和磷酸化、糖基化蛋白质的低丰度，使得直接对其进行质谱分析成为一个巨大的挑战[1-8]。因此，在质谱分析之前建立一种有效的磷酸肽、糖肽富集方法对于处理复杂的生物样品是至关重要的。
蛋白质磷酸化是生物体内一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，磷酸化与去磷酸化是可逆的双向调节过程，生物体通过这一过程，可以调控自身的细胞通讯、信号传导等多种生命活动，而不正常的磷酸化会使生命活动产生紊乱。但是，磷酸化肽在蛋白质水解产物中常表现为低丰度。因此，如何简便高效地实现对磷酸化蛋白或磷酸肽的富集，是磷酸化蛋白质组学中非常重要的研究内容[9]。目前用于从复杂生物样品中鉴定磷酸肽、糖肽的富集方法包括免疫沉淀、离子交换色谱(Ion exchange chromatography, IEC)、金属氧化物亲和色谱(Metal oxide affinity chromatography, MOAC)和固定化金属离子亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)。在这些方法中，MOAC是广泛发展的用于磷酸化肽段的富集方法。普遍认为，金属氧化物具有两性性质，在酸性条件下，金属氧化物呈现路易斯酸，能够与磷酸化肽段中电负性的磷酸基团结合，而在碱性条件下呈现路易斯碱，失去与磷酸基团结合的能力，导致磷酸化肽段被洗脱下来，可对磷酸肽实现高选择性富集。一系列金属氧化物已被用于MOAC，包括二氧化锡(SnO2)、二氧化钛(TiO2)、二氧化锆(ZrO2)、Al2O3、ZnO等[6]，基于TiO2的MOAC法是目前最为成熟的富集法。
蛋白质糖基化是最重要的翻译后修饰之一，许多蛋白质功能的实现都与糖基化修饰密切相关。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程。最近，随着亲水相互作用色谱技术的不断发展，其在多肽分离、药物分析等方面都有较好的应用。两性亲水作用色谱法(Zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography, ZIC-HILIC) 是一种直接分离极性和亲水性化合物的色谱技术[10]。亲水作用色谱(Interaction liquid chromatography, HILIC)采用亲水的极性材料为固定相，水-有机相为流动相，与正相色谱类似，对强极性的化合物有很强的保留。由于甘露糖、葡萄糖、半乳糖等单糖分子中含有大量的羟基，使糖链具有极强的亲水性，未糖基化的蛋白或肽段的疏水性强，因此很多亲水性层析介质可用来富集糖蛋白或糖肽。糖类化合物因其极性强，在反相色谱模式下保留较弱，因此常用HILIC对其进行分离分析。ZIC-HILIC由于其操作简单、快速，与质谱兼容性好，不破坏糖链结构，且能对N-型和O-型糖蛋白都实现高灵敏度富集等优点，被广泛应用于糖蛋白质组样品分析中。
Yilin Li[6]等通过水热反应合成了Fe3O4纳米粒子，然后制备了TiO2-ZrO2并将其包覆在Fe3O4微球上。最后，通过介孔二氧化硅壳层在Fe3O4@ TiO2-ZrO2上的自组装，成功地合成了Fe3O4@ TiO2-ZrO2@mSiO2。利用各种仪器对Fe3O4@ TiO2-ZrO2@mSiO2进行了表征和形貌分析。采用美国麦克ASAP2020物理吸附仪、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）对材料的粒径、孔径大小、孔径分布、材料的分散性等进行表征，采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR），X射线能谱（EDX）验证材料包裹成功后所具备的特殊元素Fe、Si、Ti等。用动态光散射(DLS)测定了颗粒的流体力学直径。用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)验证了Fe3O4@ TiO2-ZrO2@mSiO2的成功合成。进行氮气吸附，确定Fe3O4@ TiO2-ZrO2@mSiO2的主孔尺寸等详细信息。
Yayun Hong[11]等用溶剂热法合成了磁性Fe3O4纳米粒子，然后按照文献的方法，通过STouml;ber溶胶-凝胶法在SiO2壳层表面包覆了磁性Fe3O4纳米粒子[12，13]。随后，通过TBOT水解在Fe3O4@ SiO2纳米颗粒上沉积了TiO2薄膜。最后，将得到的FFe3O4@ SiO2@ TiO2纳米粒子在NaOH水溶液中进行水热处理，使光滑的TiO2层被刻蚀，同时外延生长成TiO2纳米片。同时，对二氧化硅中间层进行了刻蚀，最终产物具有独特的蛋黄壳花状结构。用TEM和FE-SEM观察了产物的表面形貌和粒径。用EDS和XRD对产物的元素组成和晶体结构进行了表征。在Fe3O4@H- fTiO2纳米粒子中可以清楚地观察到Fe和Ti的峰，Si物种几乎完全被去除。X射线衍射图谱进一步表明Fe、Ti元素以氧化物形式存在。利用振动样品磁强计对纳米颗粒进行了研究，结果标明两个样品都表现出典型的磁滞回线，反映了超顺磁性。用氮气吸附-脱附法测定了Fe3O4@H-fTiO2纳米粒子的比表面积、孔容和孔径。
马成[14]等将ZIC-HILIC作为N-糖肽和N-糖的富集材料，分别对人血浆中N-糖链和N-糖肽展开了 研究。该方案中，首先采用FASP的样品制备方法，随后将酶切肽段分成了两个部分，一部分采用优化的ZIC-HILIC富集方法对糖肽进行富集，随后用PNGaseF酶切N-糖肽，并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析。
本课题拟先合成不同孔径大小的磁性介孔二氧化硅材料，利用其表面丰富的硅羟基接枝TiO2, 进行材料的表征和初步的选择性富集磷酸化肽段测试。在富集效率最优孔径的磁性介孔二氧化硅基础上拟构建一种新型杂合MOAC和ZIC-HILIC双功能介孔磁性纳米材料，即将TiO2和L-半胱氨酸(L-Cys)键合在同一基质上，一次性实现MOAC和ZIC-HILIC方法的串联，减少样品损失，为磷酸化肽段、完整糖肽的富集提供一种新策略。
参考文献
