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课题名称 |
UPLC-MS/MS法检测人血浆中佐匹克隆的分析方法开发和验证 |
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研究目的和 意义 |
佐匹克隆（别名唑吡酮、吡嗪哌酯）为非苯二氮䓬类新型镇静催眠药，具有起效迅速、半衰期短、成瘾性低、不蓄积、不良反应少、几乎没有宿醉效应等特点。然而，佐匹克隆的药物治疗窗较窄，误服或过量服用易导致昏迷中毒。本研究旨在建立快速、灵敏分析人血浆中佐匹克隆浓度的UPLC-MS/MS分析方法。该方法将遵循国内外的指导原则进行完整的方法学验证。该方法的建立和完整验证不仅对佐匹克隆的临床药代动力学试验的人血浆样本的分析提供参考，也可用于临床血药浓度检测，为抢救误服过量服患者或法医学提供依据。 |
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国内外 文献综述 国内外 文献综述 |
佐匹克隆(Zopiclone)，化学名称为6-(5-氯吡啶-2-基）-7-[(4-甲基哌嗪-1-基）羰氧基]-5,6-二氢吡咯[3.4-b]吡嗪-5-酮，为白色至淡黄色结晶性粉末。无臭、味苦，易溶于二甲亚砜或氯，较易溶于冰醋酸或无水醋酸，难溶于甲醇、乙腈、丙酮或乙醇，极难溶于乙醚或异丙醇，几乎不溶于水。佐匹克隆为环吡咯酮类第三代催眠药。系GABA受体激动剂，与苯二氮䓬类催眠药作用于相同受体，不同区域，且药效更强。实验证实，佐匹克隆除催眠、镇静作用外，还具有抗焦虑、抗惊厥和肌松作用。佐匹克隆口服吸收迅速，用药后1.5-2小时即可达血药浓度峰值，生物利用度为80%，血浆蛋白结合率为45%，通过肝脏代谢，约80%药物以代谢物的形式由肾脏排泄，消除半衰期为5-6小时。 目前国内外佐匹克隆的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相-质谱法（GC-MS）、液相-质谱法（LC-MS）等。超高效液相色谱（UPLC）作为一种新型色谱技术，与传统的HPLC相比，其速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。串联质谱（MS/MS）中，第一个质量分析器将离子预分离或加能量修饰后由第二个质量分析器分析结果，则可以从干扰严重的质谱中抽取有用数据，极大的提高质谱的选择性，显著降低背景噪音，进而测定混合物中的痕量物质。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）则由于分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的检测器分析速度快，分离效果好，应用范围广，成为目前最好的用于分析微量或痕量有机混合物的仪器。目前UPLC-MS/MS技术在国内外应用方面有药学领域的药物研发、临床药学中同时使用多种药物时对其血药浓度进行同时检测、法医学中对人体内残留痕量药物的检测等。该技术在各个领域的应用日益广泛，逐步取代HPLC，成为主流的分析方法。 建立UPLC-MS/MS法检测人血浆中佐匹克隆的分析方法时选用内标法作为其色谱定量方法。内标法通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算，一定程度上消除了操作条件变化引起的误差；操作过程中样品和内标混合注入色谱柱，只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响定量结果；抵消了上样体积，以及流动相、检测器的影响。添加的内标物质应为待测物保留时间应接近,但不重叠的高纯度标准物质，或含量已知物质，并且在给定色谱条件下具有一定化学稳定性，且原样品中不含该组份。可知酒石酸唑吡坦及地西泮均能作为内标物使用。 分析前血浆样品常用的处理方法有蛋白沉淀（PPT）、液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。由于PPT适用于样品中浓度较高的药物测定，且处理后干扰物质仍较多，残余的杂质易堵塞色谱柱，污染仪器，故不采用该处理方法。LLE时溶剂可用乙酸乙酯或冰醋酸。SPE则可以使用C18或HLB固相萃取柱，而不使用MCX固相萃取柱，因为佐匹克隆在碱性条件下较易降解，回收率会降低。 色谱条件和质谱条件的建立应首先参考国内外文献和数据库，再根据所使用仪器的参数条件进行优化，在质谱条件确立后可以以此为检测方法进行色谱条件的优化。 对该分析方法的方法学验证可参考我国于2015年颁布的中国药典(ChP 2015)中通则 9012“生物样品定量分析方法验证指导原则”，但在实际操作中要尽量避免接近该标准。在对UPLC-MS/MS法检测人血浆中佐匹克隆的分析方法的方法学验证中需要验证以下项目：选择性、标准曲线、定量下限、精密度和准确度、提取回收率、基质效应（包括溶血和高脂效应）、残留效应、稳定性。其中稳定性研究应包括：生物样品长期冻存、反复冻融、生物样品[前处理过程（包括采集、处理过程）、制备后保存条件下的稳定性]和待测物标准溶液及内标标准溶液（室温放置、长期储存的稳定性）两部分。 |
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研究目标 |
建立快速、灵敏的UPLC-MS/MS法检测人血浆中佐匹克隆浓度的分析方法。方法学验证项目包括以下内容：选择性、标准曲线、定量下限、精密度和准确度、提取回收率、基质效应（包括溶血和高脂效应）、残留效应、稳定性。其中稳定性研究应包括：生物样品长期冻存、反复冻融、生物样品[前处理过程（包括采集、处理过程）、制备后保存条件下的稳定性]和待测物标准溶液及内标标准溶液（室温放置、长期储存的稳定性）两部分。 |
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研究内容 研究内容 |
建立UPLC-MS/MS法检测人血浆中佐匹克隆浓度的分析方法。首先是对超高效液相色谱的色谱条件及串联质谱的质谱条件的优化；其次是血浆样品处理方法的筛选和确定；最后是对该分析方法进行完整的方法学验证，包括以下项目： 1 选择性 选择性的验证表明已建立的分析方法能够将基质中的目标分析物和内标与内源性物质或其他物质进行符合标准的区分。一般是通过处理至少来源6个不同个体（批次）的未混合基质来进样。进样的结果中，在目标分析物和内标的出峰位置仪器的色谱峰仪器自动积分结果应满足干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20 % ,并低于内标响应的5% 2 标准曲线和定量下限 标准曲线是通过在空白基质中加入已知浓度的目标分析物（含内标），制备不同浓度的校正标样，以仪器对分析物的响应和内标的响应比进行回归来获得。校正标样和质控样品的非生物基质比例（如加入的工作溶液）应不超过5%。在限定误差能满足预定要求的前提下，用特定方法能够准确定量测定被测物质的最低浓度或含量，称为该方法的定量下限。标准曲线中校正点回算的浓度应在标示浓度的plusmn;15 %以内，定量下限的标准是在plusmn;20%内。 3 精密度和准确度 药典指导原则推荐使用更多的浓度水平来验证精密度与准确度。4个浓度水平（LLOQ，LQC,MQC和HQC）是最少的要求，如果标曲范围的跨度较大，可以适当增加浓度水平。准确度和精密度均需要上报批内和批间的数据。批间的要求定义为至少2天，至少3个批次。对于准确度，无论批内还是批间，准确度一般应在质控样品标示值的plusmn;15%范围内，对于定量下限，应在标示值的plusmn;20%范围内。批间和批内的精密度标准是变异系数一般不得超过15% ，定量下限的变异系数不得超过20% 。 4 提取回收率 在实践中，回收率的考察需在三个质控浓度中进行，通常用CV%来作为接受依据。 5 基质效应 通过在有基质存在下的响应峰面积（空白基质提取后加目标分析物和内标），与不含有基质的相应响应峰面积（目标分析物和内标的纯溶液）比值，计算每一分析物和内标的基质因子。基质效应的衡量是通过计算经内标归一化的基质因子，即分析物的基质因子除以内标的基质因子。特殊基质是药典指导原则的新内容，其属于基质效应的考察内容，所以特殊基质考察的接受标准是可以与基质效应相同的。方法学验证中这部分验证不可或缺。包括溶血基质和高脂基质。溶血是生物样品分析中最常遇到的问题之一。由于大量内源性成分溢出进入血浆，可能对分析物的准确定量可能产生很大影响。血液中引起基质效应的主要内源性成分为磷脂、胆固醇和甘油三酯。这些成分常因以下因素产生变化：药代动力学及生物等效性试验中，需进行餐后给药试验，餐后血脂含量增加；因受试者代谢功能的差异等原因，很有可能造成采集到的血浆样品中血脂含量高；一些肥胖志愿者 的血样也有可能含有比正常血样稍多的脂类。 6 残留效应 残留效应在实际实践中时有出现，取决于药物自身的性质、仪器系统、分析方法和操作习惯等。残留的接受标准为在高浓度样品（定量上限）之后在空白基质样品中的残留应不超过定量下限响应的20%，并且不超过内标响应的5%。在方法学验证中，残留纳入分析和核查，而且后续的生物样本分析也要汇报残留的数据。 7 稳定性 稳定性的研究包括生物样品长期冻存、反复冻融、生物样品[前处理过程（包括采集、处理过程）、制备后保存条件下的稳定性]和待测物标准溶液及内标标准溶液（室温放置、长期储存的稳定性）两部分。 方法学验证完成后，分析处理得到的实验数据并作出结论。 |
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参考文献 参考文献 |
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