开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景：
肝纤维化是由各种病因所致的慢性肝损伤的共同病理改变，是慢性肝病进展为肝硬化的必经阶段。肝星状细胞(HSC)是肝脏的一种非实质细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞间的窦周间隙，是肝纤维化的主要效应细胞。在各种损害因素如乙醇、药物毒性、病毒感染等的刺激下，HSC可进行上皮-间叶转化形成肌成纤维细胞，开始肝纤维化进程。同时，邻近细胞如肝细胞、Kupffer 细胞、肝窦内皮细胞等可分泌多种细胞因子如转化生长因子-beta;(TGF-beta;)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子 (HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，与HSC膜上受体结合，通过多种信号转导通路介导HSC激活和增殖。HSC激活、增殖是肝纤维化发生、发展的关键环节。
近年来，随着对肝纤维化的深入研究，发现长度为19 ～25个核苷酸的内源性单链非编码微小RNA(miRNA)可以参与转录后基因表达调控。一个转录本的总体结构由5′非编码区（5′UTR）、编码区（ORF）和3′非编码区（3′UTR）组成。其中3′UTR具转录本特异性，对mRNA转录后修饰、维持mRNA的稳定性及蛋白质翻译效率等方面起重要作用。miRNA可以与相应靶基因mRNA的3′UTR区以碱基互补配对原则结合形成二聚体，引起靶基因mRNA降解或者翻译抑制。与靶基因mRNA 3′UTR完全互补的miRNA可直接引起mRNA降解，与3′UTR不完全互补的miRNA则抑制mRNA翻译成蛋白质，从而实现对靶基因表达的负调控。同一个miRNA可以结合多个靶基因的3′UTR区，同一个基因3′UTR区也可以结合多个 miRNA，实现真核生物复杂的转录后调控，抑制目的基因翻译，并可调控TGF-beta;、核因子-kappa;B(NF-kappa;B)、PDGF等信号转导通路。以mRNA为靶点，通过软件预测可获得能与mRNA 3′UTR区结合的大量miRNAs，但是预测结果需要进一步的实验来验证其靶点结合特异性，从而确认是否具有对靶基因的调控功能。通常采用荧光素酶报告基因系统来验证靶点特异性，去除不具功能性的预测结合的miRNA，其基本原理是miRNA与其靶基因mRNA 3′UTR区结合后，可抑制报告基因蛋白的表达，只要检测报告基因蛋白即可。将靶基因 mRNA 3′UTR 区定向克隆至荧光素酶报告基因载体，系统中加入待验证的miRNA，如果miRNA可以与重组载体上3′UTR区互补结合，则抑制载体上荧光素酶表达，表明该miRNA可以实现对靶基因的特异性调控,从而获得该miRNA与靶基因的功能相关性信息。诸多研究显示，miRNA通过作用于HSC在肝纤维化进展中发挥重要作用，可以通过荧光素酶报告载体验证具体作用位点。
miR-185最初被认为是癌症进展过程中的调节因子，位于染色体22q11.21。miR-185 靶向DNMT1/PTEN/Akt通路抑制严重联合免疫缺陷小鼠的HCC细胞生长，研究发现miR-185通过与大脑中富含的Ras同源物（RHEB）的3′UTR相互作用诱导HCC的强效自噬。最近的研究表明，miR-185的表达减弱可能是引起特发性肝纤维化的原因。
miR-451被鉴定为NAFLD炎症过程中的靶基因。在高脂肪饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠的肝组织中miR-451表达显著降低，在NASH患者的肝脏标本中也观察到其表达降低。研究表明，miR-451能够抑制促炎细胞因子的产生，其过表达可能对脂肪细胞中的LKB1 /AMPK / AKT信号传导具有潜在的抑制作用。由此可见，miR-451在预防从单纯性脂肪变性进展为严重晚期肝病方面存在潜在治疗应用。
本研究主要探索miR-185及miR-451荧光素酶报告载体的构建过程及这两种miRNA与mRNA的作用位点验证，证明miRNA在肝纤维化进程中的直接作用与其潜在治疗价值。
预期实验方法：
1．预测靶向关系
利用TargetScan、miRWalk等数据库预测miR-185与EphB2、miR-451与c-Myc的靶向关系。
