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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 课题背景： 1型糖尿病（TIDM）是由于胰岛beta;细胞的分泌能力受到破坏而引起机体丧失调节血糖能力的一种自身免疫性疾病。热休克蛋白60（Hsp60）是胰岛beta;细胞的主要自身抗原之一，其上一段特异性多肽VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED（P277）是与效应T细胞反应的抗原决定簇。目前已有临床试验证明皮下注射P277能预防和治疗1型糖尿病。按照国外方法免疫胆固醇膳食家兔时会诱发严重的动脉粥样硬化副作用，研究发现在动脉硬化斑块周围有大量P277抗体聚集，这表明在P277肽中除存在调节细胞免疫应答的T表位也存在引发体液免疫的B表位。本实验室已通过查阅资料解析肽段相关表位后找到动脉硬化大概B表位所在，替换或删除B表位后发现虽然副反应得以消除但其治疗T1DM降低血糖能力也会降低，这说明B表位对T表位的免疫作用是有辅助共刺激作用的。 本课题欲通过表位扫描技术在蛋白水平确定出精确B表位，在最大程度保证T表位完整性和B表位空间结构的前提下，通过单个或数个氨基酸突变或删除改造B表位，并通过后续的ELISA及抗体-补体介导的细胞毒性实验验证扫描所得B表位是否正确，能否降低或消除B表位带来的动脉粥样硬化，或者因为改造B表位而产生了一个作用效果更为强的B表位诱发更严重的动脉粥样硬化。 拟研究的问题：
3） 不同的优化方式（单突变和全突变）效果的差异。 实验流程：
1确定P277肽B表位所在 实验已由本实验室师姐卢世平完成 扫面结果分析，确定B表位应该在440-446,ALLRCI. 2 配制所需溶液 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（0.05mol/l,PH9.6) 碳酸钠-1.59g,碳酸氢钠-2.93g，定容至1000ml. PBS溶液（氯化钠-8g，氯化钾-0.2g，碳酸钠-1.44g，磷酸二氢钾-0.24g，定容至1000ml.） ELISA封闭液（含5%BSA的PBS溶液) ELISA样品稀释液（含2%BSA的PBS溶液） PBST溶液（含0.5%Tween的PBS） 硫酸（2mol/l,50ml)等
1对B表位氨基酸进行优化改造 确定B表位所在氨基酸位置（ALLRCI），将其突变为Ala或直接删除，（P1组全突变为AAAAAA）（P2组删去ALL变为RCI)、(P7为P277全肽-阳性对照）、（油剂为阴性对照，成分为力保肪宁），用以下方法免疫小鼠，ELISA测定P277抗体滴度，IgG/IgG1/IgG2a。与P277及前几条小肽比较后确定B表位破坏肽。 2给药 8周龄左右BALB/c小鼠24只分为4组（P1 P2 P7 油剂），给药，间隔2周，共给药3次。80ug/只，皮下给药。 饲养方法：无毒塑料鼠盒，不锈钢丝笼盖饲养小鼠。温度18～29℃，相对湿度40～70％；最好控制在18～22℃，湿度50～60％。每两天笼子、笼盖酒精消毒并换垫料（已灭菌烘干），食料灭菌烘干后给小鼠食用，饮水为放凉后的开水。 3取血 每次给药前及给药后一周眼眶取血，取出后静置待血清析出后离心取上层血清进行ELISA，之后冻存备用。 4 ELISA ① 肽段溶于包被稀释液，1mu;g/mu;l，每孔加入100mu;l 4℃包被过夜。 ② 弃去包被液，每孔加入200mu;l 5%BSA封闭液，37℃封闭2h。 ③ 弃去封闭液，每孔加入1：100 5%BSA封闭稀释液＆小鼠血清100mu;l，37℃封闭2h。 ④ 弃去血清，没空用PBST和纯化水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次。 ⑤ 洗涤后，每孔加入5%BSA封闭液稀释＆HRP标记＆抗小鼠IgG二抗100mu;l，稀释倍数1000,37℃孵育1h。 ⑥ 弃去酶标二抗稀释液，每孔用PBST和纯水间隔洗涤，每次3min，共6次。 ⑦ 洗涤后，每孔加入100mu;l底物液（过氧化氢尿素和TMB溶液），37℃反应30min。 ⑧ 加入2mol/l硫酸终止反应，用酶标仪在450nm波长测定每孔光密度值。 5 抗p277抗体识别血管内皮细胞 ①共聚焦检测p277抗体对HUVEC细胞表面抗原的识别 亲和纯化的抗p277特异性抗体与培养的人血管内皮细胞（HUVEC， 37℃一直培养或者42℃热休克30分钟）孵育过夜，PBS洗涤三次后加入荧光素标记的二抗（goat anti-mouse IgG/FITC）孵育3h，用PBS洗涤三次用，在共聚焦显微镜下观察，拍照。 ② Western-blot 3 times; 106 HUVEC在42℃热休克30min，随后在37℃培养3小时。细胞经洗涤后回收，裂解。100mu;g细胞裂解蛋白进行还原条件下的12%SDS-PAGE电泳，转到硝酸纤维素膜上进行Western-blot杂交实验，一抗用纯化的HSP65特异性抗体或者纯化的p277抗体或者对照抗体。 ③ HUVEC细胞免疫组化分析 HUVEC在42℃热休克30min，随后在37℃培养3小时。细胞经洗涤后，用等体积比的甲醇和丙酮固定20min，随后用0.1%Triton X-100透化处理5min。接着用5%BSA封闭，再用纯化的抗p277抗体或者对照抗体37℃孵育2h。洗涤后用HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (diluted 1:400)孵育，最后显色。 ④ 抗体-补体介导的细胞毒性实验 HUVEC接种于两块96孔板中，每孔1 times; 104个细胞。培养过夜后，其中一块板进行热休克，方法同前述。每块板的细胞都被分成5组，加入30mu;l的抗体溶液和10mu;l的补体溶液：（PBS 培养基，PBS 补体，对照抗体 补体，p277抗体 补体）。补体血清取自豚鼠，不含有抗p277或者anti-HSP65/60抗体。37℃培养24h后，活细胞用MTT显色。细胞杀伤率（%）=（1-ODX/OD PBS 培养基）times;100%。
2015年3月之前------预实验（由本实验室师姐完成） 2015年3月1日--2015年3月5日 研读文献，了解开题方向。 2015年3月6日--2015年5月1日 进行试验（给药，取血，ELISA，细胞毒实验) 2015年5月-2015年6月 对实验数据进行分析处理，撰写论文，结题。 预期结果： 小鼠注射经过改造的P277肽，ELISA测定P277肽抗体滴度，与之前实验的小肽及P277全肽相比，改造后的P277肽应该不会再产生B表位抗体，但是否还会造成动脉粥样硬化需通过抗体-补体介导的细胞毒实验进一步确定，及对I型糖尿病的治疗效果还需通过皮下注射免疫NOD小鼠进一步探究其作用效果。 参考文献： [1] 吴洁；申丽丽；黄东成；金亮；李国梁；刘坤锋；杨雪；刘晓锐. 新型疫苗肽IA-2-P2对1型糖尿病的治疗作用. 药物生物技术[R] 2014(4)[2] 朱爱华；吴梧桐；刘晶亮.I型糖尿病疫苗的研究进展.中国药科大学学报.2015(1)[3] 朱爱华；鲁勇；金亮；吴洁；李泰明；刘晶亮.P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用.生物工程学报[R] 2008,04(027)
[4] 卢世平；金亮；吴洁.I型糖尿病疫苗的临床研究进展.中国药科大学学报.2014(06)
[5] Yong L,Yunxiao S,Qiyan X, et al. Immunization with P277 induces vascular leak syndrome in C57BL/6 mice via endothelial damage[J].Autoimmunity ,2010,43(8):654-663.
[6] Britta Fischer,Dana Elias,Reinhard G Bretzel,Thomas Linn. Immunomodulation with heat shock protein DiaPep277 to preserve beta cell function in type 1 diabetes – an update[J]. Expert Opinion on Biological Therapy . 2010 (2)
[7] Tchilian E, Ahuja D, Hey A, et al. Immunization with different formulations of Mycobacterium tuberculosis antigen 85A induces immune responses with different specificity and protective efficacy[J]. Vaccine, 2013, 31(41) |
