开题报告内容：
重组牛肠激酶催化亚基制备新方法研究
[研究的主要目的和意义]
肠激酶（Enterokinase，EK或Enteropeptidase，EP，EC3.4.21.9）是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶，最早由Schepowalnickow于1899年在Pavlov的实验室发现。1939年，Kunitz证实了肠激酶是一种胰蛋白酶激活剂。
迄今为止，已从人、鼠、猪、牛等身上纯化出天然的肠激酶，其中以牛肠激酶的理化性质研究的最为透彻。牛肠激酶分子量为150kDa，由一条115kDa的重链（结构亚基）和一条35kDa的轻链(催化亚基)以一个二硫键连接而成，在pH值4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物，主要机理为：重链把轻链附着在肠粘膜刷状缘上并朝向肠腔，轻链基团能特异性识别胰蛋白酶原中Asp-Asp- Asp- Asp-Lys序列并在C端水解肽链，释放出活性胰蛋白酶。1984年，Light A和Fonseca P证实：分离的牛肠激酶轻链仍具有全酶所具有的特异性切割活性。
目前许多具有商业开发价值的药物蛋白质和多肽，如抗骨质疏松药物重组人甲状旁腺素、肿瘤坏死因子-beta;、磷脂酶A2、白细胞介素-11等，均采用融合蛋白表达，工艺要求用蛋白酶切割融合蛋白，释放出目的蛋白，这为肠激酶提供了广阔的市场空间。但天然肠激酶来源有限，并且从动物组织提取的肠激酶污染有其他蛋白酶，这给实际应用带来了困难。这就要求用基因工程的方法生产高纯度的肠激酶。基因工程方法生产的高纯度肠激酶活性与天然肠激酶相似，但比天然肠激酶切割速率更快。
我们准备用基因工程方法在毕赤酵母中分泌表达有生物活性的牛肠激酶催化亚基-His6，通过一系列分离纯化，获得纯的带组氨酸标签的牛肠激酶催化亚基，为基因工程下游过程中重组融合蛋白的切割提供一个有效、廉价的工具酶。
