PTCV（premature termination codon-harbouring virus）疫苗的制备
流感是由于流感病毒引起的流行性疾病，每年都会有很多人感染流感并死亡。流感分为多种亚型，有A(甲型)，B（乙型），C（丙型）。其中以A型流感病毒最容易发生变异，根据其抗原的突变由可分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型。流行性感冒主要是通过空气传播，
目前，针对流感的治疗方法中，以疫苗和抗病毒药物为最常见。目前有很多已投入临床使用的抗病毒药物，比如：金刚烷胺(amantadine)，金刚乙胺(rimantadine)，扎那米韦等。疫苗的出现是人类的历史上的里程碑，接种疫苗是预防病毒感染最有效的手段，在过去的几百年里挽救了无数的生命。疫苗分为灭活疫苗，减毒疫苗，亚单位疫苗，重组基因组疫苗。灭活疫苗是将病毒液通过物理或化学的方法处理使其变成无感染致病性但仍保留其抗原的疫苗。减毒疫苗则是通过培养筛选，筛选出毒力较弱的毒株，但是这种疫苗容易发生回复突变，所以这种疫苗有潜在的致病感染性。亚单位疫苗是通过分离纯化病毒颗粒的部分组分而制备的疫苗，由于其具有病毒颗粒的蛋白质，所以保留了病毒的抗原性。重组基因组疫苗是通过将病毒的某段基因插入到载体中，然后转入细胞使其表达出病毒的蛋白，从而刺激免疫系统靶向并杀死病毒，这种方法可以避免在最初研制疫苗的时候由于接触活疫苗而带来的危险。
在研制流感病毒疫苗的过程中，需要了解相应亚型的基因组及蛋白表达。而现在多数亚单位疫苗的研发则是根据流感病毒的某些蛋白的抗原性进行研究开发。流感病毒是由包膜，核心，基质蛋白组成。流感病毒是由八个节段组成的节段型病毒，每个节段是一个RNP复合体，这个复合体是由流感病毒的一条基因组RNA负链，病毒的核蛋白和聚合酶组成。八个节段编码病毒的九种蛋白质：PB1,PB2,NS,M1,M2,NP,HA,NA（神经氨酸酶）,PA。其中PB1，PB2和PA为病毒粒子的聚合酶，NS为病毒粒子的非结构蛋白质，M1为病毒粒子的基质蛋白，M2为病毒粒子的离子通道蛋白质，HA和NA分别是血凝素和神经氨酸酶，这两种蛋白质是突变频率最高的两种蛋白质，根据其突变的类型，可将流感病毒分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9。和很多病毒的感染周期类似，流感病毒的感染周期可以概括为：（1）吸附与入侵，病毒蛋白HA通过识别细胞膜上的唾液酸受体，从而吸附到细胞表面，然后通过细胞的胞饮作用进入细胞。（2）基因组的释放，RNP复合体进入细胞中并在核定位信号的引导下进入细胞核。（3）转录和复制，在PB1，PB2和PA的作用下，病毒基因组利用细胞的原料及营养物质合成自身的蛋白质以及基因组。（4）组装与出芽，当细胞内的原料及营养物质被消耗殆尽无法支持自身的生命活动时，病毒粒子将进行组装并以出芽的方式释放到组织液中，而细胞将裂解死亡。基因重排以及基因重组常见于节段性病毒中，当多个病毒粒子入侵并进入同一个细胞时，由于基因组之间的高度同源性，序列之间会发生部分重组，这也是造成流感病毒高度变异的一个重要的原因。另外，不同病毒粒子之间的基因组还会发生重排，即整个病毒节段进行交换。
近年来，基因密码子扩展技术为流感疫苗的发展提供了一个崭新的平台。自然界中一共存在64中密码子，编码20种氨基酸。其中有三种终止密码子，分别为UAA.UAG,UGA。Peter Schultz为首的科学家发现了在古细菌中存在另外一套可以利用终止密码子编码的非天然氨基酸系统。经过长期正交筛选，最终寻找到了一套完整的正交氨酰tRNA合成酶-氨基酸系统。在细胞中引入非天然氨基酸系统可以使premature termination codon通读并引入非天然氨基酸，但不会使正常的终止密码子被通读。通过这种方法，我们可以利用这一套系统在目的蛋白的特定位点来研究蛋白的结构功能以及与其他蛋白质或小分子的相互作用。2016年，北京大学药学院周德敏实验室1利用PTC技术，在病毒基因组中引入PTC，并使用非天然氨基酸将PTC位点通读，这样就可以获得PTC病毒。这种病毒可以入侵细胞，但不会进行基因组复制，因此这种病毒对人体的影响很小，并且这种病毒疫苗的安全性也在实验中被证实。当PTC病毒的基因组进入细胞时，PTC的基因节段会与野生型病毒的节段进行基因重排或基因交换，从而使野生型的病毒基因组被引入PTC，最终野生型的病毒将无法被复制并走向死亡。
然而，这一种新型的研发疫苗离临床仍有很大的距离。目前实验室仍然无法准确的确定合适的能够突变成PTC的病毒氨基酸位点。根据上述原理，我们可以利用PTC技术和带有非天然氨基酸系统的稳定细胞系生产PTC疫苗。在本课题中，我将十二质粒系统通过转染进带有非天然氨基酸系统的HEK293T细胞生产PTC病毒。在病毒的八节段中，本课题将选取不同的氨基酸位点，并将其突变成UAG，然后生产PTC病毒疫苗，并通过qPCR或者试验测定其滴度。本课题将建立相应的非天然氨基酸稳定细胞系并对细胞系的合理性进行评价，然后本次课题将评价该非天然氨基酸稳定细胞系与流感病毒十二质粒生产系统的兼容性以及生产出来的PTC病毒疫苗的遗传稳定性。
PTC病毒疫苗除了通过与野生型病毒发生基因重排或基因重组来治疗病毒感染，还可以刺激机体产生抗体，从而杀伤流感病毒。但是PTC病毒疫苗的治疗效果仍然很弱，需要通过寻找合适的PTC位点或者探寻病毒基因组的高重组率或重排率位点来提高PTC病毒疫苗对野生病毒株的保护作用。
参考文献：
1. Si, L. L.; Xu, H.; Zhou, X. Y.; Zhang, Z. W.; Tian, Z. Y.; Wang, Y.; Wu, Y. M.; Zhang, B.; Niu, Z. L.; Zhang, C. L.; Fu, G.; Xiao, S. L.; Xia, Q.; Zhang, L. H.; Zhou, D. M., Generation of influenza A viruses as live but replication-incompetent virus vaccines. Science 2016, 354 (6316), 1170-1173.
