开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
沙门氏菌是一类兼性厌氧革兰氏阴性菌, 能够靶向进入肿瘤组织的乏氧区和坏死区域并生长繁殖,有显著的抑瘤效应, 国内外报导了许多针对减毒沙门氏菌抗肿瘤效果的研究。减毒沙门氏菌菌株VNP20009是在鼠伤寒沙门氏菌基础上敲除purI和msbB毒性基因得到的,毒副作用降低，靶向性和肿瘤治疗效果更好[1]。虽然在临床I期研究中，其抗肿瘤效果较弱，但是也证实了其具有较高的生物安全性[2,3]。沙门氏菌聚集在肿瘤组织中的机制还未完全阐明，目前主要有三种机制来解释其肿瘤靶向性：1.细菌在肿瘤内的选择性生长。肿瘤细胞快速增殖的特性会导致肿瘤内部产生低氧区和坏死区域，相比于正常组织，肿瘤内部含有的营养物质更加丰富，如嘌呤和各种生长因子等，兼性厌氧的野生型沙门氏菌更偏向于此生长繁殖[4]。 2.趋化作用。肿瘤微环境中分泌某些化学物质，可使具有运动能力的沙门氏菌向肿瘤迁移。例如野生型沙门氏菌富集于肿瘤坏死区域是受核糖/半乳糖受体介导的，敲除细菌的核糖/半乳糖受体编码基因后，细菌会聚集在肿瘤静止区且诱导肿瘤细胞死亡[5,6]。3.肿瘤微环境中的免疫抑制。细菌在体内主要是被机体免疫清除，例如巨噬细胞的吞噬作用等，而肿瘤中的细胞免疫反应较低，有利于沙门氏菌的生长繁殖。
L-门冬酰胺酶是目前最有效的抗肿瘤酶抑制剂之一，广泛应用于临床治疗急性淋巴细胞性白血病和恶性淋巴瘤。正常的细胞可以从血液中获得门冬酰胺，或通过胞内的门冬酰胺合成酶合成门冬酰胺来维持自身正常的生命活动[7]。但肿瘤细胞内的门冬酰胺合成酶的含量很低，主要从血液中获得门冬酰胺来维持生长繁殖，而L-门冬酰胺酶可以专一性地将门冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，从而导致胞外的门冬酰胺大大减少，使得肿瘤细胞蛋白质合成障碍而引起肿瘤细胞死亡,但正常机体细胞仍可合成足量门冬酰胺以满足自身需要。但是有相关文献报道[8-10]，沙门氏菌可以通过表达L-门冬酰胺酶来抑制宿主T细胞的活化、增殖及细胞因子的分泌，从而建立自身的感染。
Red两步同源重组法可用于细菌定点基因敲除，以pKD46[11]作为同源重组质粒，该质粒为低拷贝温敏型质粒，具有氨苄抗性，并将噬菌体的exo、bet、gam基因整合于阿拉伯糖启动子控制下；质粒pKD3和pKD4为打靶DNA的获得提供模板，分别带有氯霉素和卡那霉素抗性基因，并赋有FRT[12]位点（翻转酶结合位点）；pCP20质粒含有flippase[12]基因，表达的FLP翻转酶可以与FRT位点结合并消除抗性基因片段[13]。具体方法：第一步，将一段含有FRT位点的抗性基因置换入宿主染色体待敲除区域；第二步，将质粒pCP20电转化入宿主细胞，利用其表达的FLP翻转酶将抗性基因敲除[14]。两步同源重组法操作简单、实验周期短、打靶精确度高，是目前细菌基因敲除领域应用最为常见的方法[15]。但该方法需要将外源DNA电转化入宿主细胞，因此对DNA片段的浓度以及感受态的效率要求较高。
使用沙门氏菌作为肿瘤治疗工具或靶向载体时，其表达的门冬酰胺酶会抑制T细胞免疫应答，加剧了肿瘤微环境中的免疫抑制。为了探究门冬酰胺酶在减毒沙门氏菌抗肿瘤作用中的作用，我们以VNP20009为基础并通过Red同源重组特异性地敲除ansB基因，评价Delta;ansB菌株的抗肿瘤效果。
二、实验方法
1. 构建Delta;ansB菌株及分析其体外特性
Delta;ansB菌株的构建：根据ansB的位置和碱基序列设计引物，引物合成后进行PCR反应获得产物，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，制备重组DNA片段。Red两步同源重组法敲除ansB，使用抗性平板进行筛选，并使用PCR进行分子水平鉴定, 构建Delta;ansB菌株。
Delta;ansB菌株体外特性分析：将Delta;ansB菌株接种至LB液体培养基中37℃摇床培养，每隔一定时间测量OD值，绘制细菌生长曲线。Western Blot分析Delta;ansB菌株门冬酰胺酶表达水平，测定沙门氏菌中门冬酰胺酶酶活，从蛋白质水平测定Delta;ansB菌株是否构建成功。
