文献综述
目的 探讨多重 PCR靶向富集结合高通量测序技术在结直肠癌 (colorectalcancer，CRC)中检测错配修复 (mismatchrepair，MMR)基因种系突变的应用
结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是全世界第三大常见恶性肿瘤[1]。
如今医学对结直肠癌的检测分析已经比较清晰，本篇论文主要还介绍了通过50基因实体瘤检测试剂盒找出与结直肠癌发生、发展相关的热点突变，为患者指导用药；可发现与结直肠癌发生、发展相关的新基因Marker，为结直肠癌的进一步研究奠定基础。多重PCR靶向富集结合高通量测序技术用于MMR基因的外显子突变检测准确且经济、高效，其与临床表型对照研究，可为 Lynch综合征遗传风险的评估和治疗方案的制定提供新的参考[2]。
通过10例结直肠癌组织样本致病基因研究多重PCR及二代测序在结直肠癌检测中的应用，通过50基因的实体瘤检测试剂盒可发现与结直肠癌发生、发展相关的热点突变，为患者指导用药；可发现与结直肠癌发生、发展相关的新基因Marker，为结直肠癌的进一步研究奠定基础。方法是：结直肠癌石蜡组织切片 → DNA提取 → 对提取后的DNA进行定量、质控 → 进行多重PCR → 文库构建 → 上机测序 → 对10例石蜡样本进行信息分析 → 发现热点变异。作为最重要的分子生物学分析方法之一，DNA测序不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。已经应用于基因组，包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面［3］。然而，许多科研人员仅知道高通量测序技术的大概原理，而对于该技术在生命科学领域的应用却知之甚少。为此，本文详细阐述了高通量测序技术在结直肠癌热点基因突变筛查上的应用。目前研究认为 ， 结直肠癌有两种基因组不稳定途径：染色体不稳定(chromosomal instability ，CIN ) 途径和微卫星不稳定(microsatellite instability．MSI)途径。约 85％的结直肠癌中存在染色体不稳定。从而导致KRAS、RAF等癌基因激活和APC、P53等抑癌基因失活，这种异常表达不断累积促使肠上皮细胞完成从正常管状腺瘤不典型增生癌 这一过程[4]。国外多项研究表明，使用抗表皮生长因子受体(EGFR，epidermal growth factor)抑制剂西妥昔单抗或帕尼单抗治疗结直肠癌，其治疗有效性与下游基因RAS状态有关[5]RAS基因是抗表皮生长因子信号转导通路中一个重要的下游控制基因，包括KRAS基因、NRAS基因。其中突变型的RAS基因不需抗表皮生长因子受体接受信号，不仅能自动激活该通路，同时能启动下游基因的转导，因此，RAS基因可影响抗表皮因子受体单抗治疗的疗效。同时，结直肠癌组织中其他下游基因如BRAF基因也会影响抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗的疗效[6]。本文就对结直肠癌组织中热点突变基因包括KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因突变情况进行检测分析，旨在为临床治疗提供参考依据。
另外约50%的结直肠腺癌发生p53基因点突变,且常伴有17P染色体的等位基因缺失。p53基因点突变常导致一种较稳定的蛋白堆积于恶性细胞中,此蛋白可用免疫组化方法测定。在正常细胞中,采用标准方法测不到这种蛋白。在结直肠癌时4070%的肿瘤存在p53过度表达。对p53作为一种肿瘤抑制因子起作用的机制尚缺乏了解。正常情况下,通过各种机制引起的细胞内DNA损伤,导致p53堆积并阻止细胞在Gl期循环,细胞在此期修复损伤,如果损伤太严重,细胞便以程序性死亡的方式自杀。Lane的模型中,p53灭活时肿瘤细胞不能进入G1期,因此这些细胞在遗传上不稳定,更易造成遗传损伤迅速叠加。在这种情况下,P53起着基因组卫士的作用而维护基因组的完整性[7]。
化疗的疗效和毒性反应存在着明显的个体差异，尽管年龄、肝肾功能状态、肿瘤生物学特性以及合并用药等可能影响化疗疗效，药物代谢酶、转运体、作用受体及靶点等基因多态性也在很大程度上影响着化疗疗效[8]。而通过多重PCR及高通量测序可以准确知道基因突变位点，再给予分子靶向给药，对提高病人生存率有很好帮助。随着越来越多物种基因组的公布，全基因组重测序成为基因组学研究的一个新思路。通过该方法，可以将重测序结果与已有参考基因组序列进行比对，寻找出全基因组范围的ＳＮＰｓ、插入／缺失突变（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ，Ｉｎｄｅｌ）、拷 贝 数 变 异 （ＣｏｐｙＮｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）、结 构 变 异 （ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＶａｒｉａｔｉｏｎ，ＳＶ）等遗传变异信息[9]。其与本文所讲通过50基因实体瘤检测试剂盒找出与结直肠癌发生、发展相关的热点突变，发现与结直肠癌发生、发展相关的新基因Marker较类似。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤关系最为密切的基因，也是人类恶性肿瘤中最常见的突变基因。人的p53基因位于 17号染色体短臂上长约16～2O kb由l1个外显子组成，编码着393个氨基酸组成的核磷酸蛋白，因其分子量为53 kD而得名。p53分为野生型和突变性，在正常人体起作用的是野生型的p53。 p53抑癌基因的可能机制在于：参与细胞周期调节，使细胞不能进入S期，从而抑制细胞的增生，同时亦修复损伤组织；下调凋亡抑制蛋白家族中的survivin表达，诱导细胞凋亡；可抑制环氧化酶的表达而抑制肿瘤细胞分化及转移；抑制血管内皮生长因子(VEGF)活性，阻断肿瘤细胞的生长[10]。
