开题报告
一、拟研究或解决的问题：
本课题拟建立阿霉素诱导的小鼠肾小球足细胞损伤模型方法学并应用建立的模型对参乌益肾片中所含的约30个化合物进行抗足细胞损伤活性筛选研究，为参乌益肾片改善足细胞损伤的药效物质基础研究提供数据支撑。
二、采用的研究手段：
1 小鼠肾小球足细胞的培养
当细胞生长在对数生长期时，倒掉培养液，PBS轻轻荡洗后弃去，加入0.25 %胰蛋白酶消化1 min左右，放置显微镜下观察。当细胞皱缩，细胞间隙变大时，加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打为细胞悬液，一部分细胞计数后接种于96孔板中，培养24h后进行后续实验；一部分细胞接种于培养皿中，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。
2 阿霉素诱导的小鼠肾小球足细胞损伤模型的方法学建立
足细胞细胞计数，以5times;103、1times;104和2times;104个/孔的密度接种于96孔板，每孔100mu;l培养24h后，每个细胞密度下分别用0、0.5、1、5、10、20、40、80mu;g/ml的阿霉素进行诱导足细胞损伤，以对照组的OD值（1.0-2.0之间）和细胞损伤率（30%-60%之间）来确定细胞密度和阿霉素的损伤剂量，若两个衡量标准均为达到需继续更改参数优化细胞密度、造模剂量及造模时间。
3 待筛选化合物在足细胞上的细胞毒考察
足细胞根据模型方法学中确定的细胞密度接种于96孔板中，培养24h后将板中的培养基弃掉，更换为150mu;l的无血清DMEM；同时将参乌益肾片中所含的化合物用DMSO溶解为100mg/ml的母液，用无血清的DMEM培养基稀释250倍后吸取50mu;l加入到细胞培养板中，体系稀释4倍，对照组中加入DMSO，稀释方法同化合物组，DMSO浓度为千分之一，化合物均稀释1000倍；给药24h后进行细胞活力检测，已细胞存活力90%以上视为对细胞无毒，对于细胞存活力低于90%以下的需降低药物浓度再进行后续的活性筛选。
