开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、背景介绍：
肿瘤免疫疗法是通过利用自身免疫系统来治疗肿瘤的一种疗法。现阶段肿瘤免疫治疗主要是针对继发性免疫系统中的T细胞来进行设计[1,2]，比如CAR-T细胞，免疫检查点抑制剂疗法等。但现阶段肿瘤免疫治疗面临着两大挑战：仅少部分人能够响应产生疗效；可能会诱发严重的自身免疫反应[3]。攻克目前肿瘤免疫治疗挑战具有重要意义。然而，除了继发性免疫系统中的T细胞，先天性免疫细胞在肿瘤杀伤中也发挥了重要作用[4,5,6] 。目前，基于先天性免疫细胞的肿瘤免疫治疗方法的开发主要包括利用巨噬细胞、树突状细胞分泌的细胞因子对免疫系统的调控[7]；利用自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤等[8]。
然而，作为先天性免疫细胞重要成员之一的中性粒细胞在抗肿瘤中的作用常常被研究者忽视。可能是因为中性粒细胞的两面性：具备抗肿瘤能力但同也具备促进肿瘤发生发展的能力[9]。但是中性粒细胞的抗肿瘤能力是不能忽视的。有大量的研究表明，在特定情况下，中性粒细胞有较强的抗肿瘤能力的，通过分泌活性氧(ROS)[10]，比如过氧化氢和一氧化氮实现对肿瘤细胞的杀伤，或者通过抗体介导的肿瘤杀伤 [11]。中性粒细胞产生的活性氧在肿瘤杀伤中发挥了重要的作用，同时活性氧也是中性粒细胞发挥先天性免疫功能的重要方式[12]。中性粒细胞在受到外界刺激后，产生活性氧（ROS），包括超氧阴离子、过氧化氢和次氯酸[13]。其中过氧化氢和次氯酸是中性粒细胞发挥抗肿瘤作用的物质基础。
很多因素影响中性粒细胞ROS的产生。首先，ROS的产生主要依赖于中性粒细胞NADPH氧化酶2（NOX2）的激活[14]。NOX2由六种蛋白质组成。p22phox和gp91phox形成跨膜蛋白cytb558,另外四种可溶性蛋白质p47phox、p67phox、 p40phox和 Rac2分布于细胞质中。在静息状态下，cytb558位于细胞膜或囊泡膜上，其余蛋白散布在胞质中。当中性粒细胞受到外界环境刺激之后，NADPH氧化酶2有静息状态经历priming状态后激活，产生呼吸爆发， NOX2催化氧气变成活性氧。在priming的过程中，NOX2的蛋白亚基的空间分布会发生改变，产生部分磷酸化以及构象的转变，最终组装到细胞膜或囊泡膜上，变成激活态的NOX2[15]。在priming过程中，蛋白p47phox发挥重要作用。在外界环境刺激下，如TNF-alpha;或GM-CSF，能够促进p38MAPk以及ERK激酶的激活从而使p47phox磷酸化并发生构象的变化，促进蛋白在细胞膜上的组装。有研究表明，预先用TNF-alpha;或GM-CSF priming后的中心粒细胞在激活后，中性粒细胞产生活性氧的能力显著增强[16]。
其次，NOX2利用NADPH的电子传递产生ROS[17]，细胞内充足的NADPH供给是产生足量ROS的前提。正常生理条件下，中性粒细胞摄取葡萄糖通过磷酸戊糖途径产生NADPH[18]；此外在糖源缺少的情况下，比如在肿瘤环境中，中性粒细胞可以通过线粒体以脂质代谢和谷氨酰胺的代谢方式提供NADPH[19]。此外，中性粒细胞产生ROS的能力与中性粒细胞的类型相关。研究表明，在骨髓来源的中性粒细胞中，成熟的中心粒细胞产生ROS的能力远强于未成熟的中性粒细胞，并且在分泌ROS的分泌过程中，成熟的中性粒细胞基因的表达水平与未成熟的具有显著性的差异[20]。
基于以上研究，调控NOX2的激活过程，调控NADPH产生的代谢途径和选择成熟的中性粒细胞能够实现对中性粒细胞ROS生成能力的调控。基于此，本课题的研究目标是通过以上途径强化中性粒细胞分泌活性氧的先天性免疫能力，增强中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而将中性粒细胞开发为一种新的免疫药物，为现阶段肿瘤免疫治疗的挑战提供新的解决思路。
二、设计思路：
将中性粒细胞应用于肿瘤的治疗面临着两大挑战：第一是异常的肿瘤微环境。肿瘤的快速生长从环境中摄取大量的营养物质，造成低糖的肿瘤微环境[21]。低糖环境不利于中性粒细胞通过以葡萄糖为基础的NADPH的产生。此外，成熟的中性粒细胞的线粒体较少，线粒体的功能弱[22]，难以通过线粒体产生足量的NADPH供应。因此，异常的肿瘤微环境不利于中性粒细胞NADPH的产生，从而削弱ROS的产生能力。第二个挑战是中性粒细胞以ROS分泌介导的肿瘤细胞杀伤依赖于中性粒细胞与肿瘤细胞的接触[23]。
因此，本课题的思路是增强中性细胞在肿瘤微环境的代谢适应和增强中性粒细胞与肿瘤细胞接触从而提高中性粒细胞的肿瘤能力。首先，增强中性粒细胞在肿瘤微环境的代谢适应。选用成熟的骨髓源中性粒细胞，在体外通过增强中性细胞糖原的合成，增加中性粒细胞葡糖的储备，从而使中性粒细胞能够在低糖环境中产生足量的NADPH。其次，体外priming中性粒细胞，使它能够在肿瘤环境中产生大量的ROS。最后，利用脂质插膜的方法在中性细胞表面修饰上叶酸分子，利用其与肿瘤表面的叶酸受体的识别作用，增强中性粒细胞与肿瘤细胞接触的概率。通过以上三种手段，增强中性粒细胞的抗肿瘤能力，将中性粒细胞开发为新型的免疫治疗手段。
