文献综述Taq DNA Polymerase纯化方法及活性研究摘要 Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一。
目的：研究Taq酶如何能够提高其纯度和活性。
方法：本实验基于已重新构建的Taq酶甘油菌加入氨苄抗生素过夜培养，将培养的细菌接入LB培养基，用异丙基硫代-beta;-D-乳糖苷诱导，后利用SDS-PAGE来测纯度，再使用提纯后的Taq酶来进行活性检测。
结果：所获得的Taq酶纯度和活性更好。
关键词：Taq DNA聚合酶、纯化、活性检测引言Mullis等[1]1985年提出聚合酶链式反应（PCR反应），1988年Saiki等[2] 在美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的水生嗜热杆菌（Thermusaquaticus）中提取了1种耐热DNA聚合酶。
虽然制备Taq DNA聚合酶的方法多，但其纯度和活性比不上国外进口的Taq DNA Polymerase。
本研究把重构过的Taq酶甘油菌诱导纯化，得到高质量的Taq DNA聚合酶。
1. Taq DNA聚合酶的特性1.1酶活性和热稳定性该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5~6min后，仍可 保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃~20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65~68℃，有Mg2 [3] 存在时，其逆转录活性更高.1.2催化活性TaqDNA聚合酶是Mg2 依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2 浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7~0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2 进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2 过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制40~50%的酶活性.由于Mg2 能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2 浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中Mg2 浓度至少应比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50~60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性.1.3忠实性 Taq酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活性，它无Klenow酶的35校对活性。
因此，在PCR反应中若出现错配的碱基，此酶无校对能力。
