开题报告内容：
一、课题背景
细胞免疫是人体免疫系统的重要组成部分 , 在清除癌变组织和病原菌入侵中发挥重大作用。T细胞在细胞免疫中居中心地位。按照表面标志 , T细胞主要分 CD8 的细胞毒 T细胞 (cytotoxic T cell,CTL), CD4 的辅助 T细胞 (helper T cell,T helper), CD4 CD25 的调节/抑制性T细胞(regulatory/suppressor T cell, Treg)。初始T细胞（naiuml;ve T cell）是指离开胸腺但还未受到抗原刺激的T细胞.这些T细胞通过在血液和次级淋巴器官之间的再循环执行着免疫监视功能,并最终分化为效应T细胞或记忆T细胞。Th亚型来源于初始CD4 T细胞。这些初始细胞分泌IL-2和表达CD45RA。早在上世纪80年代，Mosmann等发现活化的CD4 T细胞有两类，即Th1和Th2细胞，分别产生不同的细胞因子并具有不同的功能，从而证实CD4 T细胞不是一种单一的细胞，而是一系列具有不同功能的细胞群。CD4 辅助T细胞在激活后可分化为不同亚型的效应T细胞，除了经典的辅助性T细胞Th1、Th2之外，近来发现了数种其他亚型的效应细胞，如Th9、Th17、Th21、调节性T细胞（Treg细胞）等，这些细胞亚型的诱导分化条件有各自的特点，其中诱导所用细胞因子类型起到主要的定向分化作用。初始 T细胞 (naiuml;ve T cell)在胸腺组织生成后 , 在不同的条件下逐步分化为功能各异的细胞群 , 其分化过程需要特定细胞因子的正反馈调节 , 这一过程必然伴随着其他亚 群细胞分化途径的抑制。例如：IL-4促进 Th2细胞分化 , 同时对 Th1细胞分化起抑制作用；IFN-gamma;促进 Th1细 胞分化 , 同时抑制Th2细胞分化；TGF-beta; 促进 Treg细胞的分化 , 却抑制Th1和 Th2细胞的分化。
CD4 T细胞的各种亚群均在细胞免疫反应中发挥重要作用。这些作用的发挥主要通过分泌细胞因子和趋化因子激活或募集靶细胞来实现。Th1细胞介导细胞内免疫反应 , 负责细胞内病原体的清除 ,并在自身免疫性疾病发病中发挥作用 ；在人体中 ,Th1细胞在对抗分枝杆菌感染中有重要作用，其所产生的细胞因子有 :IFN-gamma;, 淋巴毒素 alpha;(LTalpha;), 和 IL-2等细胞因子。Th2细胞与细胞外免疫有关 , 其主要功能为清除机体寄生虫感染 , 同时与哮喘及其他过敏性疾病的诱发和持续有关 ,主要产生 IL-4, -5,-9, -10, -13, -25和双调蛋白 (amphiregulin)等重要细胞因子。 Th17细胞介导针对细胞外细菌和真菌的免疫反应 ,并与许多器官特异性自身免疫性疾病有关 。Th-17细胞主要产生 IL-17a,IL-17f, IL-21和 IL-22等因子。 Treg细胞在调节免疫反应和维持自身耐受方面具有重要意义。研究表明 , 增加 Treg细胞数量或增强其功能可减轻自身免疫性疾病 , 阻止异体排斥反应 ;相反 , 去除 Treg细胞或抑制其功能可以增强抗肿瘤/微生物免疫反应。
现今 ,细胞分离技术已经有了很大的发展 ,在各种分离法中免疫磁珠法和流式细胞术均可分离到高纯度的细胞 ,但流式细胞术分选有时可能影响细胞的活性 ,而免疫磁珠法具有高效 、快速对细胞活力和功能干扰少的优点 ,因此在对特定亚群细胞的功能研究中得到了广泛的应用 。免疫磁珠法(MACS)是2O世纪80年代出现的技术方法。1983年Ugelstad提出将免疫磁珠用于细胞分选，1990年，Mihenyi建立了MACS。它具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性，所以它在免疫检测、免疫吸附、细胞分离和培养等领域中得到越来越广泛的应用。免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠法分正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化。
- 要解决的问题
运用免疫磁珠法分离C57BL/6小鼠Naive CD4 T细胞。
- 研究方法和内容
将脾脏单核淋巴细胞300g离心10min后弃上清，收集所有淋巴细胞，每400mu;l分离缓冲液重悬108细胞，并加入100mu;L 的Biotin-Antibody Cccktail；混合均匀后，4℃冰箱内孵育5分钟。孵育完成后，再加上200mu;L分离缓冲液混合，加入200mu;l 的Anti-Biotin MicroBeads，以及200mu;L 的CD44 MicroBeads ，混合均匀后4℃冰箱内再次孵育10min。孵育完成后，加入2ml的分离缓冲液300g，10min清洗细胞后重悬于500mu;l的缓冲液中。
将磁分离柱装置于分离架上和磁场中备用。3ml分离缓冲液分三次润洗磁分离柱；润洗后即可在柱中加入上述细胞悬液，收集流出的未标记细胞（Naiuml;ve CD4 T），待细胞悬液完全流出后，用3ml分离缓冲液times;3次冲洗分离柱，收集流出的细胞，此时收集的细胞均为Naiuml;ve CD4 T，收集所有的未标记细胞，调整Naiuml;ve CD4 T细胞浓度为106 cells/ml。
- 工作计划
2月28日—3月17日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。
3月18日—5月10日：完成分离C57BL/6小鼠Naive CD4 T细胞工作。
