一、P2Y14型受体拮抗剂的发展状况
P2Y受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs），是一类非常重要的细胞表面受体，其拓扑结构N端在细胞外，C端在细胞内，并含有七个跨膜环结构[1]。P2Y受体包含有8个亚型，分别为：P2Y1R,P2Y2R,P2Y4R,P2Y6R,P2Y11R,P2Y12R,P2Y13R和P2Y14R。根据细胞信号作用的特定G蛋白类型分类，P2Y1R,P2Y2R,P2Y4R,P2Y6R,P2Y11R属于P2Y1型受体，通过Gs蛋白激活细胞内的PLC；而P2Y12R,P2Y13R和P2Y14R属于P2Y12型受体，作用于Gi蛋白,从而抑制腺苷酸环化酶（ACE）的活性，降低环腺苷酸（cAMP）的含量[2]。根据与受体结合的核苷酸类型还可划分，P2Y1,P2Y12和P2Y13为ADP受体；P2Y11为ATP受体；P2Y4和P2Y6为UDP受体[3],[4]；P2Y2为ATP和UTP双受体；而P2Y14较为特殊，除是UDP受体外，更主要的是UDP-葡萄糖以及其他的核苷酸糖受体[5]。
P2Y受体实际上在多数细胞和组织中都表达，包括大脑，心脏，骨骼肌，脊髓，胎盘，神经组织，免疫细胞等，并且发挥着极其重要的生物学作用，如血小板凝集，平滑肌细胞的增值和免疫调节等[6]。而P2Y14受体主要存在于心脏，胎盘，脂肪组织，胃肠道以及外周免疫细胞中，它能够提高小神经胶质细胞的超敏性，中性粒细胞的流动性[7]；增加肥大细胞释放的介质和肾闰细胞炎症，并在中枢神经系统中能够抑制星形胶质细胞释放间质金属蛋白酶和肿瘤坏死因子[8]。最近的研究表明，在P2Y14受体基因敲除的小鼠中，P2Y14的拮抗作用具有潜在的治疗糖尿病的作用[9]。
酵母菌模型试验证明了UDP对UDP-葡萄糖增强的P2Y14受体具有浓度依赖性的拮抗作用，因此，Harden等通过对UDP更深入地研究，确定了UDP为人类P2Y14受体的竞争性拮抗剂（pKB=7.8）[2]。另一项研究则发现了一个受体拮抗剂类似物5-O-硫代二磷酸脲苷，有趣的是，该研究还证明了UDP具有潜在的激动作用（rP2Y14R,EC50=0.35mu;m），这在同一配体的作用上表现出截然不同的同源性药理差异。接着，该作者通过三种均能稳定表达人类P2Y14受体的三种不同的细胞株：人类胚胎肾（HEK）293，神经胶质瘤细胞C6和中国仓鼠卵巢细胞（CHO），重新测定了UDP的作用，最终确定UDP实际上为P2Y14受体的激动剂，对应以上三种细胞株，其EC50值分别为74，29，33nm[10]。
表1 P2Y受体分类
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受体 |
组织分布 |
激动剂 |
G蛋白 |
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P2Y1 |
分布广泛，包括血小板，中枢神经系统，心脏，骨骼肌，胃肠道 |
ADP |
Gq |
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P2Y2 |
分布广泛，包括肺，心脏，骨骼肌，肾，大脑 |
ATP UTP |
Gq |
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P2Y4 |
胎盘，肺，血管平滑肌 |
UTP |
Gq |
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P2Y6 |
分布广泛，包括大脑，肺，心脏，胎盘，脾，肠 |
UDP |
Gq |
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P2Y11 |
脾，肠，树突状细胞 |
ATP |
Gq Gs |
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P2Y12 |
胎盘，大脑 |
ADP |
Gi |
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P2Y13 |
大脑，脾 |
ADP |
Gi |
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P2Y14 |
分布广泛，包括大脑，心脏，脂肪组织，胎盘，肠，造血细胞 |
UDP/UDP-葡萄糖 |
Gi |
第一个基于非核苷酸的P2Y14受体拮抗剂是由Merck公司建立并报道的化合物1的四氢吡啶[4,3-d]嘧啶骨架结构[11]，该结构是通过对Merck化合物库进行高通量Ca 流动试验筛选出的一个活性结构，后作为先导化合物进行进一步的优化。首先是对苯脲结构中苯环的修饰，活性结果表明，只要苯环的3位为乙基，3，4或3，5二取代的化合物均具有最大潜在拮抗作用。然后尝试对嘧啶杂环4位的甲苯基进行修饰，结果表明，当邻位被甲基，乙基，氯原子取代时仍具有很好的活性。在替换嘧啶杂环2位的吡啶基团时发现，若将其替换成3，4（OCH2O)-苯基得到化合物2，则具有较好的活性但最优的药代动力学参数，由此可以进一步开展体内实验，深入研究P2Y14的药理作用。而且不同于UDP介导的受体活化作用，化合物2属于非竞争性拮抗剂[12]。
之后，Merck公司又报道了另一种能够明显抑制UDP-葡萄糖活化作用的骨架结构（IC50=3.5mu;M），即4，7二取代的萘酚酸3[13],[14]，该结构在重组类人猿P2Y14受体试验中表现出明显的3HUDP竞争性拮抗作用（Ki=0.16mu;M）。在对化合物3的3，4和7位分别连接不同的取代基团，再进行全面的构效关系分析时得到化合物4。化合物4最初在C57B/6小鼠体内开展药代动力学参数试验，分别采用口服50mg/kg和静脉注射2mg/kg两种方法得到F=12%，t1/2=2.7h。进一步的研究证明，化合物4约99%在体内通过2相代谢为葡萄糖醛酸盐后，经胆汁排泄。
为了降低化合物在体内的葡糖酸代谢，药物化学家尝试降低萘酚酸结构中的电子云密度，最终得到了看似完美的化合物5，该结构具有较好的活性和优良的药代动参数（[Ki= 4n M, F = 67%(小鼠), CL = 1.6 mL.min1kg1, T1/2= 3.0 h, Cmax= 113mu;M]. 然而化合物5在含4.5%人类白蛋白的血清中具有高达99%的血浆蛋白结合率。更进一步的改造得到化合物6，该结构具有很好的药理活性和可接受的血浆蛋白结合率。为了提高口服生物利用度，化学家们利用前药原理将萘酚酸的羧基酯化[15]，得到的化合物在体内具有和化合物6近似甚至更高的血浆浓度。基于P2Y12受体的X射线衍射晶体结构，模拟化合物6与P2Y14的结合模式。由于以上化合物口服生物利用度低，合成过程繁琐且产率较低，Anna Junker等利用这一模式，对化合物6的萘酚酸结构进行生物电子等排体替换，化合物库筛选，最终确定两种类型的先导化合物结构，分别为乙炔基替换的化合物7，和三氮唑替换的化合物8。但化合物7与Tyr1023.33的氢键作用会削弱，从而降低了与蛋白质的亲和力。化合物8的氢键作用与化合物6近似，但由于较小的体积结构，另外与His1845.36有额外的pi;-pi;静电作用，但细胞活性测试结果仍低于化合物6。
二、研究的目的、内容及方法
P2Y14受体在体内分布广泛，具有多种潜在的药理价值，因此寻找更为有效的化合物极为重要。因而本课题的研究目的是1）合成阳性对照化合物PPTN；2）寻找更加有效，易于合成的P2Y14受体拮抗剂；3）进行生物活性分析。
在活性化合物PPTN的结构基础上，通过生物电子等排的策略，将PPTN中的萘酸结构替换为酰胺苯甲酸，并对对三氟甲基苯的结构部分进行一系列改造，最终得到5个目标化合物。采用人类仓鼠卵巢细胞（CHO）测定其生物活性，进一步通过P2Y14受体基因敲除的小鼠模型研究其药理活性和在疾病治疗方面的潜在作用。
图1 化合物PPTN的合成
图2 目标化合物的合成
三、论文课题进度安排
2018.02.26-2018.03.09 确定选题，查阅文献
2018.03.06-2018.03.09 撰写开题报告
2018.03.10-2018.04.15 完成目标化合物的合成
2018.0416-2018.04.30 化合物活性测试
2018.05.01-2018.05.20 撰写并提交论文原稿
2018.06.01前 修改论文，完善系统
2018.06.06前 提交正式毕业设计论文和相关成果，并准备毕业论文答辩
四、参考文献
[1]Jayasekara, P. S.; Barrett, M. O.; Ball, C. B.; Brown, K. A.;Hammes, E.; Balasubramanian, R.; Harden, T. K.; Jacobson, K. A. 4-Alkyloxyimino Derivatives of Uridine-5′-Triphosphate: Distal Modification of Potent Agonists as a Strategy for Molecular Probes of P2Y2,P2Y4, and P2Y6 Receptors. J. Med. Chem. 2014, 57 (9), 38743883.
[2]Carter RL, Fricks IP, Barrett MO, Burianek LE, Zhou Y, Ko H, Das A, Jacobson KA,Lazarowski ER, and Harden TK.Quantification of Gi-mediated inhibition of adenylyl cyclase activity reveals that UDP is a potent agonist of the human P2Y14 receptor. Mol Pharmacol ,2009,76:13411348.
[3]Meltzer, D.; Ethan, O.; Arguin, G.; Nadel, Y.; Danino, O.; Lecka,J.; Sevigny, J.; Gendron, F.-P.; Fischer, B. Synthesis and Structureactivity Relationship of Uracil Nucleotide Derivatives towards theIdentification of Human P2Y6 Receptor Antagonists. Bioorg. Med.Chem. 2015, 23 (17), 57645773.
[4]Besada, P.; Shin, D. H.; Costanzi, S.; Ko, H.; Mathe, C.; Gagneron,J.; Gosselin, G.; Maddileti, S.; Harden, T. K.; Jacobson, K. A.Structure-activity relationships of uridine 5-O-diphosphate analo-gues at the human P2Y6 receptor. J. Med. Chem. 2006, 49, 55325543.
[5]Chambers JK, Macdonald LE, Sarau HM, Ames RS, Freeman K, Foley JJ, Zhu Y,Mc Laughlin MM, Murdock P, and Mc Millan L et al.A G protein-coupled receptor for UDP-glucose. J Biol Chem,2000,275:1076710771.
[6]Abbracchio, M. P.; Burnstock, G.; Boeynaems, J. M.; Barnard, E.A.; Boyer, J. L.; Kennedy, C.; Fumagalli, M.; King, B. F.; Gachet,C.; Jacobson, K. A.; Weisman, G. A. International Union of Pharmacology. Update of the P2Y G protein-coupled nucleotide receptors: from molecular mechanisms and pathophysiology to therapy. Pharmacol. Rev. 2006, 58, 281341.
[7]Scrivens, M.; Dickenson, J. M. Functional Expression of theP2Y14 Receptor in Human Neutrophils. Eur. J. Pharmacol. 2006, 543(13), 166173.
[8]Kinoshita, M.; Nasu-Tada, K.; Fujishita, K.; Sato, K.; Koizumi, S.Secretion of matrix metalloproteinase-9 from astrocytes by inhibition of tonic P2Y14-receptor-mediated signal(s). Cell. Mol. Neurobiol. 2013, 33,4758.
[9]Xu, J.; Morinaga, H.; Oh, D.; Li, P.; Chen, A.; Talukdar, S.;Lazarowski, E.; Olefsky, J. M.; Kim, J. J. GPR105 Ablation prevents inflammation and improves insulin sensitivity in mice with diet-induced obesity. J. Immunol. 2012, 189, 19921999.
[10]Matthew O. Barrett, Juliana I. Sesma, Christopher B. Ball, P. Suresh Jayasekara,Kenneth A. Jacobson, Eduardo R. Lazarowski, and T. Kendall Harden.A Selective High-Affinity Antagonist of the P2Y14 ReceptorInhibits UDP-GlucoseStimulated Chemotaxis of Human Neutrophils.Mol Pharmacol .2013,84:4149,
[11]Gareau, Y.; Hamel, M.; Henault, M.; Hyjazie, H.; Kargman, S.; Chan, C.C.; Xu, L.; Gordon, R.; Li, L.; Mamane, Y.; Morin, N.; Mancini, J.;Therien, M.; Tranmer, G.; Truong, V. L.; Wang, Z.; Black, W. C.Synthesis and SAR of pyrimidine-based, non-nucleotide P2Y14 receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 28322835.
[12]Sean Conroy, Nicholas Kindon, Barrie Kellam, and Michael J. Stocks.Drug-like Antagonists of P2Y Receptors From Lead Identication to Drug Development.J. Med. Chem. 2016, 59, 998110005.
[13]Gauthier JY, Belley M, Deschnes D, Fournier JF, Gagn S, Gareau Y, Hamel M,Hnault M, Hyjazie H, and Kargman S et al. (2011) The identification of 4,7-disubstituted naphthoic acid derivatives as UDP-competitive antagonists of P2Y14.Bioorg Med Chem Lett 21:28362839.
[14]Ko, H.; Fricks, I.; Ivanov, A. A.; T. Harden, T. K.; Jacobson, K. A.Structure activity relaionship of uridine 5-O-diphosphoglucose(UDP-glucose) analogues as agonists of the human P2Y14 receptor. 2007, 50, 20302039.
[15]Robichaud J, Fournier JF, Gagn S, Gauthier JY, Hamel M, Han Y, Hnault M,Kargman S, Levesque JF, and Mamane Y et al. Applying the pro-drug approach to afford highly bioavailable antagonists of P2Y14. Bioorg Med Chem Lett,2011,21:43664368
一、P2Y14型受体拮抗剂的发展状况
P2Y受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs），是一类非常重要的细胞表面受体，其拓扑结构N端在细胞外，C端在细胞内，并含有七个跨膜环结构[1]。P2Y受体包含有8个亚型，分别为：P2Y1R,P2Y2R,P2Y4R,P2Y6R,P2Y11R,P2Y12R,P2Y13R和P2Y14R。根据细胞信号作用的特定G蛋白类型分类，P2Y1R,P2Y2R,P2Y4R,P2Y6R,P2Y11R属于P2Y1型受体，通过Gs蛋白激活细胞内的PLC；而P2Y12R,P2Y13R和P2Y14R属于P2Y12型受体，作用于Gi蛋白,从而抑制腺苷酸环化酶（ACE）的活性，降低环腺苷酸（cAMP）的含量[2]。根据与受体结合的核苷酸类型还可划分，P2Y1,P2Y12和P2Y13为ADP受体；P2Y11为ATP受体；P2Y4和P2Y6为UDP受体[3],[4]；P2Y2为ATP和UTP双受体；而P2Y14较为特殊，除是UDP受体外，更主要的是UDP-葡萄糖以及其他的核苷酸糖受体[5]。
P2Y受体实际上在多数细胞和组织中都表达，包括大脑，心脏，骨骼肌，脊髓，胎盘，神经组织，免疫细胞等，并且发挥着极其重要的生物学作用，如血小板凝集，平滑肌细胞的增值和免疫调节等[6]。而P2Y14受体主要存在于心脏，胎盘，脂肪组织，胃肠道以及外周免疫细胞中，它能够提高小神经胶质细胞的超敏性，中性粒细胞的流动性[7]；增加肥大细胞释放的介质和肾闰细胞炎症，并在中枢神经系统中能够抑制星形胶质细胞释放间质金属蛋白酶和肿瘤坏死因子[8]。最近的研究表明，在P2Y14受体基因敲除的小鼠中，P2Y14的拮抗作用具有潜在的治疗糖尿病的作用[9]。
酵母菌模型试验证明了UDP对UDP-葡萄糖增强的P2Y14受体具有浓度依赖性的拮抗作用，因此，Harden等通过对UDP更深入地研究，确定了UDP为人类P2Y14受体的竞争性拮抗剂（pKB=7.8）[2]。另一项研究则发现了一个受体拮抗剂类似物5-O-硫代二磷酸脲苷，有趣的是，该研究还证明了UDP具有潜在的激动作用（rP2Y14R,EC50=0.35mu;m），这在同一配体的作用上表现出截然不同的同源性药理差异。接着，该作者通过三种均能稳定表达人类P2Y14受体的三种不同的细胞株：人类胚胎肾（HEK）293，神经胶质瘤细胞C6和中国仓鼠卵巢细胞（CHO），重新测定了UDP的作用，最终确定UDP实际上为P2Y14受体的激动剂，对应以上三种细胞株，其EC50值分别为74，29，33nm[10]。
表1 P2Y受体分类
