大肠杆菌无细胞体系合成含有非天然氨基酸的蛋白质
一、研究背景
蛋白质仅仅用20种天然氨基酸执行了一系列显著功能，仅有的20种天然氨基酸携有的功能集团数量有限，无法满足化学、生物科学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求[1]，目前，通过化学修饰、基因定点突变和计算机辅助蛋白质设计，虽然对蛋白质的结构改造赋予了天然蛋白质新的功能[2]，但这些方法都依赖于20种天然氨基酸本身；其用于修饰改造的功能基团仅有疏基、羟基、羧基、氨基等几种有限基团，功能化方式十分有限[3]，与此相反，可人为赋予多样性功能基团的天然氨基酸在蛋白质修饰中表现突出[4]，这些UAAs含有酮基、叠基、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多样性功能基团，可进行多种修饰反应，如:点击化学、光化学、糖基化、荧光显色等反应[5]。通过UAAs对蛋白质进行修饰给其结构和功能的理论研究与应用带来了新的契机。
目前已经商品化的原核细胞体系有大肠杆菌无细胞体系，真核无细胞体系有麦胚无细胞体系、兔网织红细胞无细胞体系、昆虫无细胞体系和人体无细胞体系，这些无细胞体系都被广泛应用于蛋白结构和功能的研究及蛋白的翻译机制探索。尽管如此，这些不同来源的无细胞蛋白合成系统在研究蛋白质时又各具特点。
作为最早被开发的无细胞合成体系，大肠杆菌系统经历了更多的研究和关注，是应用作为广泛的无细胞系统之一。大肠杆菌无细胞系统具有很强的蛋白合成能力，在每毫升反应混合物中的蛋白表达量通常在几微克到几毫克之间[6]。该系统采用的无细胞提取物一般为S30提取物，含有蛋白合成的各种组分。半连续或连续交换无细胞模式（CECF）的开发使得反应时间大大增加，产物的表达量也大大提高[7]。无细胞提取物的制备方法[8]、能量体系的供应[9]、模板构建及反应条件的优化等研究使得大肠杆菌无细胞体系的蛋白表达情况取得了很大的进展[10]。值得一提的是，Shimizu和Ueda等通过将各种可溶蛋白因子（包括各种转录因子与翻译因子）、多种tRNA、必需的一些底物以及相应的酶混合在一起，在没有任何细胞抽取物的情况下，重建了一个PURE无细胞转录/翻译偶联体系[11]。
尽管大肠杆菌无细胞系统蛋白质合成产量很高，该系统却有俩个主要的缺点；缺乏只有真核无细胞系统才能进行的翻译或翻译后修饰的能力，使得许多真核蛋白不适于在该系统中表达；合成的蛋白质进程含有不完整的新多肽，这可能是大肠杆菌核糖体的终止造成的[12]。
二、研究意义
无细胞蛋白合成体系成为研究热点而不断取得进展是与其自身的特点密切相关的。与传统的基于活细胞的体内表达系统相比，无细胞蛋白合成体系具有众多优势。
1.无需体内表达的细胞培养过程，无细胞表达快速，一般半小时就会有一定量的蛋白质合成，反应24小时基本就可以达到反应结束，大大节约了操作时间。
