一、课题背景
1.全球癌症形势：癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。癌症作为全球第二大死因，每年导致约一千万人死亡，其临床表现症状较晚，具有难以诊断和治疗的特征。癌症的一个独特性异常细胞快速生长，这些细胞可侵袭所在组织的临近部位并扩散到其他器官，即发生转移，这是癌症致死主要原因。因此，具有靶向性的药物制剂，能抑制特定部位肿瘤细胞的快速增殖，成为前抗癌药物的研发热点。脂质体制剂因同时具有生物相容性好等特点在抗癌药物领域实现广泛应用。
2.羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin,HCPT）是由喜树的种子或根皮中提取的一种微量生物碱。它对拓扑异构酶Ⅰ具有抑制作用，能抑制核酸特别是DNA的合成，与常用抗肿瘤药物无交叉耐药、抗菌谱广，临床可用于治疗肝癌、胃癌、大肠癌、肺癌、白血病等。羟基喜树碱不溶于水，易溶于甲醇、氯仿、二甲亚砜等有机溶剂。
3.脂质体（Liposomes）是一种人工膜，主要由磷脂双分子层和胆固醇组成，粒径约25-1000 nm。磷脂双分子层的结构和生物质膜的结构非常相似，因此其生物相容性好。同时，脂质体疏水双分子层可以包载疏水药物，提高药物包封率。当前研究表明：通过修饰磷脂双分子层可达到靶向递药的目的，提高药品的生物利用度。除此之外，脂质体还具有长效、降低药物毒性、增加药物稳定性等多方面的优点。目前，众多的脂质体产品已经被分别应用于不同领域疾病的治疗，主要包括抗肿瘤、抗真菌、镇痛、基因疗法等。例如紫杉醇脂质体，主要用于卵巢癌的一线治疗、非小细胞肺癌的一线治疗以及乳腺癌的二线治疗。目前研究热点还有核酸药物脂质体，例如2018年上市的siRNA脂质体药物patisiran，它可以靶向沉默特定的mRNA，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的周围多发性神经疾病。
- 要解决的问题
早期使用的HCPT制剂，是通过内酯开环形成的水溶性钠盐而达到临床治疗浓度，该制剂半衰期短、靶向性差因而疗效较低且具有较大的毒副作用，因此我们要寻求方法来制备HCPT纳米制剂，提高药物疗效、降低毒副作用以及提高稳定性。脂质体也同样存在一些问题，例如脂质成分易氧化水解、脂质体易聚集及进入血循环后易被网状内皮系统细胞快速清除，但是可以通过优化脂质体的处方，制得粒径、电位合适的脂质体，实现药物在体内的长循环和肿瘤部位的蓄积。
- 可行性分析
脂质体对正常细胞和组织无抑制或损害作用，可长时间吸附于靶细胞周围，使药物充分渗入靶细胞组织中，还可以通过静电作用与细胞膜接触融合进入细胞内，维持疗效并降低毒副作用。且其膜材可在体内生物降解且无毒性和免疫原性，可作为HCPT的载体。HCPT具有疏水性，脂质体可将HCPT羟基内酯结构嵌入双层磷脂膜中，避免内酯结构在水环境或血液中开环，从而保持其生物活性，降低毒副作用并维持稳定性。羟基喜树碱脂质体的制备处方简单，原料易得，经济成本较低。其疏水性使其能够较稳定地包裹于磷脂双分子层中，因此工艺简单，便于临床工业大生产。因此本课题拟构建羟基喜树碱脂质体（Lip@HPCT），并通过其表征和体外药效试验判断其毒性和药效并加以改善。
- 研究方法和内容
方法：本实验拟设计采用薄膜分散法制备羟基喜树碱脂质体，通过其粒径等因素对处方及步骤进行优化，确定HCPT与磷脂比例、磷脂和胆固醇比例、有机相种类、旋蒸时间、水合时间等。并根据上述实验结果制备含羟基喜树碱脂质体，通过细胞实验对其体外药效进行评估。
内容：1）制备空白脂质体：通过薄膜分散法制备空白脂质体，称取适量的胆固醇和大豆磷脂置于50 mL圆底烧瓶中，加入适量有机溶剂，旋转蒸发一定时间，随后加入水合介质（纯化水）继续涡旋，超声适宜时间，得到均一的L脂质体混悬液。得到的混悬液根据粒径等因素优化处方比例及步骤。根据所得优化比例和步骤制备空白脂质体备用。
- 制备含药脂质体：称取处方量的胆固醇、大豆磷脂和HPCT置于50 mL圆底烧瓶中，加入适量有机溶剂，旋转蒸发一定时间，随后加入水合介质（纯化水）继续涡旋，超声适宜时间，得到均一的Lip@HPCT混悬液。
- 含药脂质体表征：
- 粒径：低速离心，分离含药或空白脂质体，通过马尔文粒径仪测定脂质体粒径，通常为100-200 nm。
- 电位：低速离心后的含药脂质体通过电位仪测定脂质体Zeta电位。
- 包封率：羟基喜树碱标准品分别配制为不同浓度，药物浓度逐渐递增，通过紫外分光光度法测定标准品的吸光度，建立标准曲线。Lip@HCPT混悬液低速离心分离游离药物和含药脂质体，含药脂质体溶液中加入甲醇破乳，通过紫外分光光度法测定包封药物吸光度，根据标准曲线算出药物浓度。羟基喜树碱脂质体混悬液同理，得出总的药物浓度，包封率计算公式：EE%=(M-Ctimes;V)divide;Mtimes;100%。其中EE是包封率，V是样品体积，C是游离HCPT的浓度，M是溶液中总的HCPT含量。
- 载药量测定：Lip@HCPT混悬液低速离心分离游离药物和含药脂质体，含药脂质体溶液中加入甲醇破乳，通过紫外分光光度法测定包封药物吸光度，根据标准曲线算出药物浓度，并根据配制体系算出脂质体包封药物的量。载药量的计算公式为：LE%(%)=Wedivide;Wmtimes;100%。其中LE是载药量，We是包封于脂质体的药物的量，Wm是载药脂质体的总重量。
- 稳定性试验：Lip@HPCT分别置于PBS/PH 7.4 和10%RPMI-1640 10%胎牛血清中，在测定时间点（0 h、2 h、4 h、12 h、24 h和48 h）检测Lip@HCPT的粒径和多分散性指数（polydispersity，PDI），用以评价Lip@HCPT的稳定性。
- 体外释放率试验：将低速离心后的含药脂质体溶液放置在PH7.4 PBS溶液中，在测定时间点（0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h）分别取样，测定记录其体外释放率，绘制图表，用以评价Lip@HPCT的体外释放能力。
- 体外药效试验：本课题采用4T1乳腺癌肿瘤细胞，MTT比色法判断羟基喜树碱脂质体对其抑制作用。将4T1细胞接种于96孔板中，孵育24 h使其贴壁。用不同浓度脂质体Lip孵育细胞24 h。同时，将Lip@HPCT与细胞孵育24 h。随后添加20mu;L MTT(5 mg/mL)孵育4 h后，弃去培养基，加入DMSO溶解结晶，使用酶标仪在492 nm波长下检测吸光度。细胞存活率（%）=（As-Ab）/(Ac-Ab)times;100%，其中As为实验孔吸光度；Ac
为对照孔吸光度；Ab为空白吸光度。用以评价不同制剂对4T1细胞的毒性。
- 工作计划
2月28日—3月20日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。
