- 实验背景
在过去的十年中，关于1型糖尿病的发病机制和自然历史的知识层出不穷，特别是在疾病的预测和非均质性，胰腺病理学和流行病学方面。胰岛素泵和动态血糖仪的技术改进有助于1型糖尿病患者应对终身使用胰岛素的挑战。有望避免疾病相关并发症的因子也已确定。然而，尽管有广泛的组织，知识，和财政投资，但这些并不意味着1型糖尿病的预防与治疗方法已经存在，并且在全球范围内，糖尿病管理质量参差不齐。1型糖尿病一般认为是与免疫相关的，如果不是直接免疫介导的，则与产生胰岛素的胰腺beta;细胞的破坏相关。[1][2]从历史上看，1型糖尿病在很大程度上被认为多发于儿童和青少年，但这种观点在过去十年中已经发生了变化，因此，发病年龄已经不再是一个限制因素。多饮、多食、多尿（与发病有关的三种经典症状）伴随着明显的高血糖是诊断儿童、青少年和少量成年人发病的标志。需要外源性胰岛素替代品也是1型糖尿病的一个主要标志，一辈子需要它来治疗。1型糖尿病流行病学的关键问题仍旧没有解决，包括目前治疗的有效性，对疾病发展的了解，疾病预防和治疗。[3]
许多自身免疫病的发病机制最初是基于先天免疫系统的冗余或长时间激活，自身免疫的过度激活经常导致慢性炎症的发生。外源性和内源性报警因子（警报素）可以诱导炎症[4][5]。最近发现的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）完全符合警报素的要求。中性粒细胞生成并释放NETs并失活的过程叫做NETosis。对NETosis的研究可以为发展慢性炎症和自身免疫病的诊断和治疗提供基础。[6]
中性粒细胞是宿主先天免疫对细菌感染产生免疫应答的关键因素。金黄色葡萄球菌是一个显著的人类病原体[7][8]，可以使健康的人产生全身性感染，从而产生了一种对有效中性粒细胞清除的抵抗。中性粒细胞胞外诱捕网的最新发现为我们对特殊的白血球如何杀死病原体的理解打开了一个新的维度。NETs由与抗菌肽、组蛋白和蛋白酶相关的核DNA骨架组成，提供一个诱捕和杀死各种微生物的矩阵。使用有针对性的诱变，研究金黄色葡萄球菌核酸酶在NET降解和小鼠呼吸道感染模型中的毒性的潜在作用。使用荧光显微镜的体外实验显示，与野生型亲本USA 300 LAC相比，基因核酸酶缺陷（NUC缺陷）突变使其降解NETs的能力明显受损。[9]因此，NUC缺陷突变株更容易被激活中性粒细胞外杀伤。此外，金黄色葡萄球菌核酸酶的产生与肺部延迟的细菌清除和鼻内感染后死亡率增加相关。总之，金黄色葡萄球菌核酸酶促进了对中性粒细胞中由NET介导的抗菌活动的抵抗，有助于机体发病。[10][11]
- 实验内容
1.LL-pCYT:SNase生长曲线测定：
（1）GM17培养液的配制 每100ml RO水中溶入4.23gM17肉汤和0.5g葡萄糖；
（2）115℃高压蒸汽灭菌20min(葡萄糖在121℃下会糊，故用115℃)；
（3）菌种活化 取5micro;l(按1permil;加)或3.75micro;l(使终浓度为7.5micro;l/ml)的氯霉素（10mg/ml）加到含5ml GM17培养基的试管中；从甘油管中取50ul的菌液（NUC）加入到上述试管中含有5mlGM17培养液的试管中（1%接种量）；30℃恒温静置培养过夜；④测OD600nm值；
（4）取75ul氯霉素（10mg/ml）加入到含有100mlGM17的培养液的锥形瓶中，使氯霉素终浓度为7.5ug/ml。
（5）按5%（8%，10%）接种量从活化管中取相应菌液加入到锥形瓶中(接种量越大，延迟期越短）。
（6）转接后于30℃恒温静置培养（在培养之前测0h的OD600nm值）。
