课题背景：
1 型糖尿病是由自身免疫性 T 细胞对胰岛素生成细胞-beta; 细胞进行攻击致使胰岛素绝对缺乏的慢性疾病。通过干预免疫应答的过程阻止自身免疫攻击可以预防并且治疗 1 型糖尿病，同时，为了避免副作用的发生，这种免疫干预过程重在免疫调节而并非是免疫抑制。
本课题研究了重组葡萄球菌核酸酶的表达、纯化及性质鉴定，用以针对1型糖尿病的中性粒细胞胞外诱捕网的降解，从而达到缓解1型糖尿病的作用。
目前尚无根治 1 型糖尿病的治疗方法，患者只能依靠注射外源胰岛素维持血糖稳定，由于 1 型糖尿病患者年龄普遍较小，有些甚至是儿童患者，注射胰岛素给他们造成巨大痛苦和诸多不便；另外注射外源胰岛素并不能有效阻止因免疫损伤所致胰岛细胞的进行性破病情恶化，难以达到理想的治疗效果，且该治疗将持续终生，大大降低了患者的生活质量。随着生命科学技术的发展，科学家和临床医生开始探索新的方法来治疗 1 型糖尿病，包括：干细胞疗法、胰岛移植、免疫抑制以及免疫调节单克隆抗体，但是这些方法由于价格昂贵、手术风险大、胰岛供体不足或是副作用多没有得到广泛应用[1-4]。
细胞死亡的方式有很多种。广泛地说,细胞死亡可以归类为程序死亡、常规死亡或意外死亡[5]。在自身免疫性疾病中,研究重点放在了细胞凋亡(靶细胞程序性死亡)或通过感染、过氧化反应或坏死(意外死亡)的死亡。但嗜中性粒细胞可以通过纤丝的网在常规通路死亡，这个网由DNA,组蛋白颗粒状蛋白组成,流到细胞表面。这些中性粒细胞胞外陷阱微生物(网)并限制炎症[6]。但这样的网也可能是有毒的,因为他们可以激活其他先天效应细胞释放炎性细胞因子,促进网络形成和暴露细胞的免疫反应抗原在前馈炎症循环[7]。本课题的产物葡萄球菌核酸酶可以有效地降解胞外诱捕网，缓解中性粒细胞胞外诱捕网的捕捉作用，从而达到抑制1型糖尿病的作用[8-10]。
主要内容：
本课题选择重组葡萄球菌核酸酶作为最终作为目的产物。主要内容包括菌体的鉴定和保藏；工程菌生长曲线的测定；工程菌诱导曲线的测定；重组葡萄球菌核酸酶的分离纯化以及产物的鉴定等。
1.菌种的鉴定和保藏：甘油管的保存：挑取阳性转化子接种于含硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，平板划线，37℃倒置培养12~16h，挑取单菌落，转接至液体培养，培养至对数生长期（OD1.5-2.0），制备甘油管，50-60%无菌甘油，1:1加菌液，甘油浓度25-30%。标记，例：BL21/pET28a-AnsB-preS2L和BL21/pET28a-AnsB-preS2C，时间，保存人。保存：-80℃（最好）菌种的活化：吸取甘油管液体20-50micro;l，接种于含50micro;g/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃振摇培养12~16h活化，再转接平板/斜面或液体培养基。斜面可作为2-3周内短期菌种保存用。质粒的琼脂糖电泳：（1）量取15ml的TAE电泳液，加入0.12g的琼脂糖（0.8%），混匀后置于微波炉中加热2分钟，充分溶解琼脂糖（注意观察，小心液体煮沸溢出）。（2）将配置好的胶倒入清洁干燥的电泳槽，安放梳子的底部边缘与电泳板之间的局里以1-2毫米为宜。（3）当溶解后的琼脂糖冷却至50℃-60℃的时候，加入核酸染色试剂。（4）将与缓冲液混匀的质粒提取液与marker分别点样于不同的孔中，80V稳压下电泳15min左右，在紫外灯下观察DNA迁移位置[11]。
2.工程菌的生长曲线测定：取一环含pET28a-SN质粒的大肠杆菌，接种于含50 micro;g /mL卡那霉素的5 mL LB液体培养基中，37℃ 恒温振荡培养 12 h（过夜），按 1%的接种量接种至新鲜的 100 mL 含卡那霉素（50micro;g /mL）的液体 LB 培养基中，转接后于 37℃恒温振荡培养，并于 0、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14.5、16 和 24 h 分别取样，测定 OD600值，描绘生长曲线。
3.工程菌诱导曲线的测定：根据所绘制的菌体生长曲线确定诱导时间。将工程菌接种至含 50 micro;g/mL Kan 的 5 mL LB 液体培养基中，37℃ 振荡培养 12 h，将其作为种子液以 1%接种量转接入 200 mL 含 50micro;g/mL Kan 的 LB 液体培养基中，根据生长曲线确定对数生长期在此加入终浓度为 0.5mmol/L 的乳糖， 37℃ 诱导培养，诱导 0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 取样，制样后进行12% SDS-PAGE 蛋白电泳分析以确定合适的收菌时间。
