⒈研究背景
医院临床研究表明单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 简称HSV)是人类最常见的病原体，HSV感染现已成为世界上第四大传染病。HSV单纯疱疹病毒的基因组为双股线性DNA组成，有HSV-1和HSV-2两种血清型，HSV-1型常引起口唇和角膜疱疹；HSV-2型则引起生殖器疱疹，并导致皮肤病变。
目前对HSV感染的治疗方法有多种 ,但效果较差, 并且对 HSV 的潜伏感染无治疗作用。因此研究有效的单纯疱疹病毒疫苗是预防疱疹性疾病的最理想方法。但传统DNA疫苗诱导的特异性免疫应答水平较低 ,所以如何增强和提高DNA疫苗的效果便成了新一代DNA疫苗设计和研究的关键问题。
为了寻求更高的体液免疫和细胞免疫效果，DNA 疫苗可以利用各种免疫佐剂与之相配合。佐剂有两大类：一种本身具有免疫原性，如抗酸杆菌，革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝，表面活性剂等。目前动物实验中应用最多的是弗氏佐剂，属于免疫佐剂，能增强抗原表面积，延长抗原在体内保留时间，使抗原与淋巴系统细胞有充分接触时间，并能诱发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。
Poly（I:C）佐剂为一种dsRNA佐剂，我国研究者将其与卡那霉素和钙复合，称为PICKCa(皮卡)。本实验研究其对单纯疱疹病毒的亚单位疫苗gD2蛋白的作用效果。
⒉拟研究的问题
本实验主要研究Poly（I:C）佐剂对HSV-2型病毒的亚单位疫苗gD2蛋白的作用效果。
⒊采用的研究手段
|
组别 |
佐剂剂量 |
gD2 |
免疫剂量（每只） |
小鼠数目（只） |
|
PBS |
-- |
0ug |
100ul |
9 |
|
PIKAamp;gD2 |
50ug/剂（肌肉） |
2ug |
100ul |
9 |
BALB/c小鼠，雌性，4-6周，每组9只，免疫三次，分别间隔4周，2周。每次免疫前和末次免疫后两周对其中4只小鼠进行眼眶取血，血液4℃静置2h后，3000rpm离心10min，取血清，-20度冻存，之后用ELISA测定血清中IgG，IgG1和IgG2a抗体效价。
对脾细胞，研磨后破红细胞，四只小鼠的脾细胞混合，在培养皿中培养沉降过夜，24h后,计数,分装至24孔板，每组分装6孔，3孔作为刺激组，3孔加PBS刺激，每孔10^6个细胞。PBS免疫组分装12孔，其中3孔使用gD2刺激，3孔加PBS刺激，2孔加非特异刺激剂PMA 离子霉素刺激以做阳性对照；其余4孔加PBS刺激后：2孔用于抗体单染调补偿（只染CD3或CD4分子），1孔不染，1孔做同型对照（染CD3、CD4及同型对照抗体）。刺激1h后加BFA（golgistop）继续培养11h，收集细胞染色。
淋巴结细胞每2只合并，计数，分装至24孔板，每孔10^6个细胞，每2只分装2孔，即每组4个孔（2孔为gD2刺激组，2孔PBS刺激以去除背景干扰），另外3只PBS组小鼠，3个淋巴结合并后计数分为3孔培养，刺激时均加PBS,其中1孔分2管用作抗体单染调补偿，1孔分2管作为同型对照组和不染色组，1孔使用非特异刺激剂PMA 离子霉素刺激以做阳性对照；刺激96h后，，加入BD公司的BFA将细胞因子阻断在细胞质内，6h后收集细胞进行细胞表面和胞内染色。（刺激96小时过程中注意每天补加10%的血清，以保证细胞活性）。
分别用Anti-CD3e-FITC、Anti-CD4-APC对CD4 T细胞表面分子进行标记，避光染色15min。 以细胞洗液洗细胞1次，500times;g离心5min，弃上清。加入0.5ml破膜剂，室温避光作用10min。以细胞洗液洗细胞1次，500times;g离心5min弃上清。分别加入Anti-IFN-gamma;-PE（其他细胞因子如IL-12可以收集上清液，用ELISA检测）及相应同型对照抗体标记细胞内因子，室温避光30min。以细胞洗液500times;g洗细胞1次，离心5min弃上清。每测试管用0.5ml的细胞固定液固定细胞。48h内用FACS-Calibur流式细胞仪进行细胞内因子的检测。
⒋参考文献
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7.关蕾，赖维等.单纯疱疹病毒 型新型 D N A疫苗的构建.岭南皮肤性病科杂志 2009年 2月 第 16卷第 1期
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11.王妍，曹淑桂.人用疫苗佐剂的发展和应用.Chin J Biologicals May 2005, Vo1. 18 No. 3
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14.潘萌，蒋浩琴，周芸，郑捷.弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的比较.《 现代免疫学》 2006 年第 26 卷第 2 期
15.Sita Awasthi，John M. Lubinski.Immunization with a Vaccine Combining Herpes Simplex Virus 2(HSV-2) Glycoprotein C (gC) and gD Subunits Improves the Protection of Dorsal Root Ganglia in Mice and Reduces the Frequency of Recurrent Vaginal Shedding of HSV-2 DNA in Guinea Pigs Compared to Immunization with gD Alone .JOURNAL OF VIROLOGY, Oct. 2011Vol.85, No. 20
⒈研究背景
医院临床研究表明单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 简称HSV)是人类最常见的病原体，HSV感染现已成为世界上第四大传染病。HSV单纯疱疹病毒的基因组为双股线性DNA组成，有HSV-1和HSV-2两种血清型，HSV-1型常引起口唇和角膜疱疹；HSV-2型则引起生殖器疱疹，并导致皮肤病变。
目前对HSV感染的治疗方法有多种 ,但效果较差, 并且对 HSV 的潜伏感染无治疗作用。因此研究有效的单纯疱疹病毒疫苗是预防疱疹性疾病的最理想方法。但传统DNA疫苗诱导的特异性免疫应答水平较低 ,所以如何增强和提高DNA疫苗的效果便成了新一代DNA疫苗设计和研究的关键问题。
为了寻求更高的体液免疫和细胞免疫效果，DNA 疫苗可以利用各种免疫佐剂与之相配合。佐剂有两大类：一种本身具有免疫原性，如抗酸杆菌，革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝，表面活性剂等。目前动物实验中应用最多的是弗氏佐剂，属于免疫佐剂，能增强抗原表面积，延长抗原在体内保留时间，使抗原与淋巴系统细胞有充分接触时间，并能诱发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。
Poly（I:C）佐剂为一种dsRNA佐剂，我国研究者将其与卡那霉素和钙复合，称为PICKCa(皮卡)。本实验研究其对单纯疱疹病毒的亚单位疫苗gD2蛋白的作用效果。
⒉拟研究的问题
本实验主要研究Poly（I:C）佐剂对HSV-2型病毒的亚单位疫苗gD2蛋白的作用效果。
⒊采用的研究手段
