课题名称 Polbeta;调控肝癌发生的分子机制研究
课题类型 毕业设计
一、课题背景
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是严重危害人类健康的全球性肿瘤，我国是受肝癌威胁最大的国家之一，约占全球肝癌死亡率的50%。自然界中天然存在着各种包括物理，化学，生物等因素可使DNA发生损伤，进而导致细胞病变，最终形成癌症。
生命机体自身有自我修复的功能，修复系统能识别DNA损伤部位并进行修复，主要概括为四种类型：光复活修复，切除修复，重组修复和SOS修复系统。而其中DNA碱基切除修复（Base Excision Repair,BER）途径是最重要的DNA损伤修复的途径之一，主要修复的是由外源性和内源性因素导致的DNA碱基氧化和烷基化。
BER途径是一个高度协调的多酶反应途径，其中涉及的酶有DNA糖基水解酶、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）、DNA聚合酶beta;（DNA polbeta;）、FEN1、DNA连接酶Ⅰ和DNA连接酶Ⅲalpha;（DNA ligaseⅢalpha;）。DNA Polbeta;同时具有DNA聚合酶（DNA Polymerase）和5rsquo;dRP水解酶活性（dRPlyase）。其DNA聚合酶活性可以利用3rsquo;-OH为引物，以另一条链为模板并将新的核苷酸加入到DNA链中，取代原来的受损位点。同时，Polbeta;的dRP水解酶活性将dRP基团从DNA链上切除，切口由DNA连接酶Ⅲalpha;连接后便完成了整个碱基切除修复过程。由于DNA Polbeta;居于BER途径的中心位置，因此，其功能及其调控在整个BER途径中起着关键性的作用，在迄今研究过的肿瘤细胞当中，超过35%被发现其DNA Polbeta;蛋白功能失调。Wilson等人在Nature上发表的研究结果显示，DNA Polbeta;基因敲除后的小鼠是致死的。如果将小鼠体内DNA Polbeta;活性抑制，小鼠虽然可以存活，但肿瘤发生率远远高于正常小鼠。
实验内容
为了研究Polbeta; R137Q突变与肝癌发生发展之间的相关性，拟从临床肝癌样本、小鼠肝癌样本以及肝癌细胞等三方面展开研究。
- 临床样本：我们与人民医院病理科合作，收集肝细胞癌病人肿瘤样本，并对上述组织进行免疫组化检测，包括利用Hamp;E染色观察肝细胞气球样病变情况、天狼星红染色观察肝脏纤维化水平、Anti-CK19和Anti-Ki-67抗体检测肝脏中胆管增生及细胞增殖情况，以确定肝癌病人病理分型和分期。
- 小鼠肝癌模型：我们拟使用DEN和CCl4联合注射造模
具体方案如下：选取置于标准环境中饲养的14日龄129/Sv雄性小鼠，腹腔一次性注射DEN（30mg/kg）。 8周龄时，给予小鼠腹腔注射CCl4 （0.5mL/kg），对照组分别给予等体积的0.9% NaCl生理盐水及橄榄油，每周两次，持续注射3个月。于小鼠第8月龄时收集肝脏组织，行上述临床样本免疫组化检测。
3. 肝癌细胞：构建人源Polbeta; R137Q突变HuH7肝癌细胞株（HuH7-R137Q），通过裸鼠异位瘤实验分析其成瘤情况，同时利用流式细胞仪及Transwell chamber等方法，观察该细胞株增殖与侵袭的变化情况，揭示R137Q突变与肿瘤发生发展的关系；
我们拟收集人源肝癌细胞株（HepG2、HuH7）和对照人正常肝细胞株HL-7702，以及小鼠源肝癌细胞株（Hepa1-6、Hepa1c1c-7、H22）和对照小鼠原代肝细胞。上述样本收集完毕后，提取总RNA并反转录成cDNA，利用PCR扩增含有Polbeta;全长cDNA片段，并用DNA测序检验是否存在Polbeta; R137Q突变的多态性。
