开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
-
研究背景
- .一氧化氮（NO）可诱导缺血耐受
作为外源性分子的NO因其参与体内的多种信号通路，可改善缺血组织的血流，还可以通过对多种蛋白进行类似于磷酸化修饰的亚硝化修饰，调控相关通路中蛋白的活性，介导抑制活性氧（ROS）的生成，从而降低对缺血组织的损伤。因此，NO是一种血管舒张因子。此外，NO还可以增加缺血部位血管生长因子的表达，促进血管新生；也可以刺激由脆弱内皮细胞组成的初期血管或不成熟血管的生长，并能募集血管周壁细胞稳定血管，改善血管功能，NO的这些生理作用被统称为缺血耐受[1]。然而，在临床上应用的硝酸甘油，硝酸异山梨酯等以NO为供体的化合物虽然具有明确的舒张血管、增加血流供应、诱导缺血耐受等作用，但难以实现靶向缺血/缺氧部位并特异性地释放NO，因此产生了副作用，限制了其在缺血性疾病中的应用。因此，研究新的NO供体型化合物，使其能够靶向缺血部位并缓慢释放适量浓度的NO，并且不影响非缺血部位的正常生理活动，是一项具有挑战性的难题。
1.2.亚硝酸根阴离子为缺血/缺氧组织中的NO前体
在氧气正常供给的条件下，NO产生后可被体内的多种活性物质通过氧化代谢为亚硝酸根离子，然后再经进一步代谢被氧化为硝酸根离子而被排出体外[2]。但在缺血/缺氧部位，生理状态下的NO合成途径由于氧气的供应不足而受到阻碍，无法产生足够的NO。此时，机体的NO产生代偿效应则会被启动：由于在缺血导致的低氧、低pH环境中，亚硝酸根可被体内的脱氧血红蛋白（deoxy-Hb）、黄嘌呤氧化还原酶（XOR）、含钼金属酶以及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）等还原为NO，从而使缺血部位NO的量得以补充，产生舒张缺血部位的血管、增加缺血部位的血流、清除自由基、抗氧化以及促进缺血部位的血管新生等多种缺血保护作用。因此，亚硝酸根被视为在缺血/缺氧组织中激活的NO前体[2]。
1.3.有机亚硝酸根供体药物的研究
已有研究表明[3]，亚硝酸钠对一些心脑血管疾病，特别是缺血/缺氧性疾病，如肝、脑、心、肾缺血再灌注损伤和肺动脉高压等，具有很好的治疗保护作用，提示亚硝酸根离子在缺血/缺氧性疾病中具有潜在的应用前景。但是直接运用亚硝酸钠来治疗缺血/缺氧性疾病仍然有许多待解决的问题[4]:亚硝酸钠在进入体内循环后可被快速代谢，半衰期仅为 25-30 min，且大剂量的亚硝酸钠给药无缺血保护作用。其原因可能与高浓度的亚硝酸钠在短时间内“爆发式”产生大量NO有关，并与超氧阴离子自由基（O2·-）反应生成氧化能力更强的过氧亚硝酸盐（ONOO-），并进一步导致蛋白、DNA等生物大分子的损伤等毒副作用。再者，若频繁进行亚硝酸钠给药，有可能对机体造成过多的钠离子摄入，对心血管产生不良影响。因此，研究和开发有机小分子化合物作为亚硝酸根的供体，使其在体内持续释放少量的亚硝酸根，实现解决在缺血/缺氧部位定位释放少量NO的难题，不仅具有重要的理论意义，而且具有潜在的临床应用价值。
1.4.膜联蛋白A5可靶向凋亡细胞
膜联蛋白是一类广泛分布的钙依赖性磷脂结合蛋白，该蛋白家族能结合钙离子，并能在钙离子条件下与磷脂结合[5]。基于分子系统发生学和比较基因组学分析，该蛋白家族被统一命名为 annexin（缩写为 Anx），其后加上大写英文字母代表不同种属：A、B、C、D、E分别代表脊椎动物、无脊椎动物、真菌和粘菌虫类、植物、原生生物[6]。人 AnxA5广泛分布于机体的各种组织细胞中，具有重要的生理功能。体外研究发现，AnxA5 具有抗磷脂酶、抗凝血、抗激酶、Ca2 通道活性及磷脂结合等多种功能，但其具体的体内功能却不是很清楚[7]。研究关注的焦点主要集中于其结合磷脂的特性，并且这一特性也被认为在细胞中起到了目前尚未被认知的关键作用[8]。 AnxA5 与磷脂酰丝氨酸（PS）高度特异性结合的特性已被应用于分子探针和药物载体等的开发。截至目前，Anx蛋白最广泛的应用是检测细胞凋亡，其中以人 AnxA5 为主，并且已有多种相关商品化产品提供。细胞凋亡时，原本位于细胞膜内侧的 PS 会翻转至膜表面，这可以作为凋亡细胞的标志物。能以钙依赖的方式与凋亡细胞表面的 PS 高亲和力结合， 从而标记凋亡细胞。值得注意的是，在缺血组织中的凋亡细胞数量也不可忽视，提示我们可以从AnxA5介导的靶向疗法，即：开发带有 AnxA5 的 PS 靶向药物，借助 AnxA5 靶向 PS 及其能够被细胞内化的特点，以提高疗效且降低副作用。研究者们发现，肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面暴露有PS，根据 AnxA5 靶向 PS 的特点，研究人员设计出 A5-CD 融合蛋白，构建了以 AnxA5 介导的靶向肿瘤细胞的 CD 前体药物疗法。体外实验表明：融合蛋白与 5-FC 联用后，对肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞具有显著的细胞毒活性，但结果尚待后续体内实验验证[9]。
2.有机亚硝酸根供体-蛋白偶联物的设计与合成
基于这些研究的启发，本课题拟运用小分子-蛋白偶联物的思路，将课题组前期研究中的有机亚硝酸根供体[2]分子结构中的酮羰基改造成缩酮结构，并通过脂肪链与马来酰亚胺末端相连，并进一步通过马来酰亚胺末端与AnxA5蛋白偶联，以达到分子体内靶向凋亡部位，并在缺血细胞内部的低pH环境诱导缩酮基团脱去，在缺血细胞内释放亚硝酸根，实现对体内缺血凋亡细胞的进一步选择，并随后由于缺血细胞内的低氧、低pH环境诱导NO代偿机制的发生，还原亚硝酸根为NO，以实现对缺血部位的靶向、选择性NO释放。
