开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
拟研究或解决的问题
癌症死亡率居高不下，其中最主要的原因之一是肿瘤向周边组织的侵袭和转移，纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)是一种多功能的糖蛋白,其与整合素结合，在肿瘤粘附和转移过程中起到很大作用。嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法是世界上目前治疗癌症的先进技术，并且在治疗血液肿瘤方面取得了很好的成果，但是在治疗实体瘤方面还有待继续研究，研究开发针对新的靶点的CAR-T细胞是目前的重要研究方向，以FN为靶点的CAR-T治疗尚未有较全面的研究，本课题拟构建以人纤粘蛋白为靶点的CAR进而研究它的活性。
研究意义
- CAR-T疗法是现在治疗癌症的前沿技术，研究针对不同靶点的CAR-T治疗癌症是免疫治疗中的重大突破，国内外关于FN与癌症转移关系的报道也不少，但鲜少有人将这两者结合起来，构建靶向FN的CAR-T治疗，因此本课题具有创新性和前沿性。
- CAR-T疗法针对血液肿瘤的治疗已经取得了重大成果（CD19-CAR-T），但针对实体瘤始终缺少特异性的靶点，有研究表明在晚期和转移性肾细胞癌或结直肠癌患者中FN高表达，且FN与胃癌的不良预后有关，本课题选用FN作为靶点对治疗实体癌具有重要性和实用性。
- 目前针对不同靶点的CAR-T治疗研究很多，CAR-T结构设计也有具体阐述，因此本课题具有可操作性。
采用的研究手段
确定FN抗体的单链可变区片段→将FN抗体scFv和CAR的CD3-delta;序列及共刺激分子用基因工程的方法整合成一个整体序列并测序→通过酶切酶连将上述序列插入慢病毒表达载体中→氯化钙法制备感受态菌，热激法转化→抗生素抗性筛选并挑取阳性菌落，sanger测序验证→摇瓶扩大培养扩增工程菌，提取质粒→采用4质粒系统包装慢病毒，脂质体转染293T细胞→经慢病毒组装、释放，最终在细胞培养上清中收获大量慢病毒→收获的慢病毒液经超速离心浓缩→流式细胞术测病毒滴度
技术路线
文献综述
CAR-T疗法与纤维连接蛋白
摘要：对肿瘤的研究治疗是目前国内外的热门话题，嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)疗法靶向识别表达在肿瘤细胞表面的抗原，特异性杀伤肿瘤细胞，近年来已经成为肿瘤免疫疗法的研究热点。而以人纤维粘连蛋白为靶点的CAR-T细胞免疫治疗尚未有完整的研究。本研究拟构建靶向人纤粘蛋白的 CAR慢病毒表达质粒，用4质粒系统包装慢病毒，并用流式细胞术测定病毒滴度。
