开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景
肿瘤是机体在各种致瘤因子的作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，根据新生物的细胞特性及其对机体的危害程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，恶性肿瘤又称癌症。国家癌症中心2017年的报告显示，中国是癌症大国，癌症病人占全球癌症病人总量的近40%，在我国，每天约有一万人确诊癌症，平均每分钟就有7人确诊，肺癌和消化系统癌症在高发病率的同时也有这较高的死亡率，严重威胁人类的健康。目前癌症治疗的主要医疗方式是手术治疗、放化疗治疗和靶向药物治疗，虽然这些治疗方式都有一定的成效，但也都有他们的局限，例如手术治疗需在癌症早期进行，而靶向药物治疗费用较为高昂，因此，研究肿瘤的发生发展，探究肿瘤细胞的代谢机制，为治疗癌症提供新的思路与新的药物靶标，具有重要的意义。
与正常细胞不同，恶性肿瘤细胞常表现出以下特征，即持续产生促进细胞生长的信号、能对抗抑制生长信号、细胞处于无限增殖状态、能够逃避细胞凋亡、自主获取新生血管及营养、具有侵袭和转移能力以及异常的能量代谢。其中，代谢是细胞进行各种生理活动的基础，细胞的代谢紊乱与其生理状况异常密切相关。恶性肿瘤细胞的主要代谢方式为糖酵解而并非氧化磷酸化，即著名的“瓦伯格效应（Warburg effect）”，这种代谢方式消耗大量葡萄糖，产生较少的ATP，并产生大量作为细胞增殖原料的小分子，在肿瘤细胞进行快速增殖的同时，产生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）来促进肿瘤的氧化应激。而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)作为一种辅酶，是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，在细胞防御活性氧损伤反面起着重要作用。一般认为，正常细胞主要通过磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）产生NADPH，约占60%。而近年来研究发现，在某些肿瘤细胞中，苹果酸酶1（malic enzyme 1， ME1）产生的NADPH占总细胞内的30%，而磷酸戊糖通路的贡献度下降至30%。因此，靶向苹果酸酶1有望成为肿瘤治疗的新方法。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是一种从水母中分离提取的荧光蛋白，由于其生色团被周围严密的桶状结构保护着，不容易被外界环境变化干扰淬灭，其荧光十分稳定，GFP及其衍生物已经成为当今生命医学研究领域重要的研究工具之一。其中，GFP的一种突变体,环形排列荧光蛋白（circularly permuted fluorescent protein, cpFP）由于具有易感受外界环境的变化这一特性，通过在其两端加上不同的响应蛋白，从而设计出各种荧光探针。常规的对NADPH水平的测量依赖分子自身微弱的自发荧光，从而评价细胞代谢活动和线粒体的功能，这种方法存在信号弱，特异性差等缺点，因此，一系列用于监测氧化还原代谢的荧光探针应运而生。Tao 等报道了一种自编码的可以检测活细胞内NADPH水平的荧光探针iNap。这种探针可以特异性结合NADPH，相对之前的探针有较高的灵敏度，并且在一定的pH范围内测量结果具有稳定性，其原理主要是通过测定其在420nm和485nm处激发光强度的比值来确认NADPH的浓度，可以在活细胞内检测NADPH的水平，使实时动态监测细胞内NADPH的水平得以实现。
- 研究目的
肿瘤细胞与正常细胞在NADPH的主要来源上存在差异，本课题拟通过抑制苹果酸酶1，比较正常细胞与肿瘤细胞内NADPH以及细胞命运的变化，并针对目前缺乏苹果酸酶1抑制剂的情况，拟基于重组蛋白水平与NADPH荧光探针等方法，对一系列苹果酸酶1的候选抑制剂进行筛选，以期找到有效的苹果酸酶1抑制剂。
- 研究思路
- 抑制苹果酸酶1对正常细胞与肿瘤细胞内NADPH水平及细胞命运变化的研究。
通过siRNA沉默苹果酸酶1，利用质谱分析检测其NADPH水平，通过CCK8等方法对细胞命运变化进行测定。
- 基于重组蛋白水平，对苹果酸酶1候选抑制剂进行初步筛选。
通过大肠杆菌表达苹果酸酶的重组蛋白，与候选抑制剂共同孵育后，加入反应底物，利用NADPH在340nm处激发荧光的特性，用酶标仪记录反应速率，以此评价候选抑制剂的抑制效率。
- 通过使用NADPH荧光探针，对初步筛选得到的候选抑制剂在细胞水平进行进一步筛选。
将包含荧光探针信息的质粒转入细胞，给予初步筛选有效的抑制剂，并对体系的荧光水平进行实时监测，以确定候选抑制剂在细胞水平的有效性。
- 参考文献
【1】Matthew G, Vander Heiden et al. Understanding the Warburg Effect:
The Metabolic Requirements of Cell Proliferation [J]. Science, 2009, 324(5930):1029-1033.
