课题名称 JSPH-42人血浆药物浓度测定方法学验证课题性质 应用课题一、研究背景近年来，质谱技术的快速发展及其高灵敏度、高特异性和高准确度的特点，使得其在临床检验中得到的关注越来越多，应用也越来越广泛。
液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）由于其适用分析的化合物范围广泛（极性和非极性化合物），且一次分析可检测多个化合物，获得丰富的化合物结构信息，是目前在临床领域应用最广泛的质谱技术，已广泛应用于遗传代谢病检测、毒理和滥用药物监测、治疗药物监测、类固醇激素检测、营养素检测等多个方面。
临床LC-MS/MS检验的对象，均为存在于生物样本（如血浆、血清、全血、尿液、唾液、胆汁、组织等）中的生物标志物，生物样本基质高度复杂，使得临床LC-MS/MS方法的开发与验证具有其自身的特殊性，因此，LC-MS/MS分析方法用于临床常规检验之前，必需进行条件优化和性能验证，分为方法开发和验证两个主要方面。
方法开发的过程包括：文献检索、质谱方法建立、液相方法建立和前处理方法建立四大步。
第一，文献检索。
文献检索过程要解决的问题包括：（1）样品前处理方法：样品类型、样品量、处理方法的选择，需要考虑样品处理的效果、试剂、耗材及时间成本；（2）质谱方法： 离子化方式、质量分析器的选择、仪器型号、扫描方式的选择、离子检测通道及相应质谱参数；（3）液相色谱方法：色谱柱的选择、流动相的组成、洗脱方式、进样量。
第二，质谱方法建立。
质谱方法建立需完成以下步骤：配制纯标准溶液进行质谱扫描，根据目标分析物的极性大小选择合适的离子化方式（ESI、APCI、APPI等），并确定正负离子模式；确定定性定量离子对，在实现分析方法特异性和灵敏度要求的基础上，最好选择两个以上质谱响应高、选择性好、稳定性好的特征碎片离子分别作为定量和定性离子；临床LC-MS/MS方法大多为定量检测，通常采用多反应监测（MRM）或选择性反应监测（SRM）扫描方式；确定合适的离子源参数和扫描参数。
第三，建立液相色谱方法建立。
液相色谱方法的建立需要考虑以下内容：色谱柱的选择，包括填料类型（非极性固定相C18、C8、C4、苯基柱等，极性固定相氰基、硅胶、氨基等）、色谱柱可耐受PH值范围（分析物的酸碱性质）；流动相的选择，包括流动相的纯度（超纯水、色谱级溶剂）、流动相的种类（甲醇、乙腈、水等）；流动相添加剂的选择，使用挥发性添加剂（甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等），尽量不要使用不挥发性添加剂（硫酸盐、磷酸盐等），防止影响离子化效率，损坏仪器；洗脱方式的优化，包括采用等度洗脱还是梯度洗脱、起始溶剂的比例、运行时间、柱温、进样体积等；考虑到临床样本基质的复杂性，尽量选择梯度洗脱模式。
