- 实验背景
肿瘤细胞与正常细胞相比具有许多遗传性以及表观遗传性改变，理论上可以提供足够数量的抗原，被免疫系统识别区分，进而引发抗肿瘤免疫反应。但是肿瘤相关的免疫抑制使得肿瘤抗原难以引发有效的抗肿瘤免疫。在有效的抗肿瘤免疫过程中，T细胞作为核心的执行者，首先被T细胞受体（TCR）介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节T细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。在生理情况下一方面参与维持对自身抗原的免疫耐受，避免自身免疫性疾病，另一方面避免免疫反应的过度激活对组织造成的损伤。肿瘤细胞可以通过免疫检查点，抑制T细胞激活，从而逃避免疫杀伤。因此，通过不同的策略增强T细胞的激活对肿瘤免疫治疗具有重要意义，其中针对免疫检查点的阻断是增强T细胞激活的有效策略之一。以免疫检查点阻断为代表的肿瘤免疫治疗与其他治疗的联合正在被日益关注，越来越多的证据显示传统的化疗药物具有免疫调节作用，免疫治疗与其他治疗尤其是与化疗的联合是今后发展的趋势。
T细胞激活信号通路的调节诱发有效的抗肿瘤免疫反应是一个多步骤的复杂过程，其关键的环节在于主要执行者效应T细胞能够有效识别并杀灭肿瘤细胞。T细胞的活化是其挥效应的前提。肿瘤细胞可以利用免疫检查点抑制T细胞的激活，从而逃避免疫系统的杀伤。经典的双信号激活理论认为T 细胞的活化需双信号，第一信号由抗原递呈细胞（APCs）上MHC-Ag 复合体与TCR 特异性结合传递，第二信号来自于APCs表达的共刺激分子与T细胞表达的相应受体的结合。其中最为重要的是T细胞表面的CD28与B7.1（CD80）的结合，若缺乏第二信号将引起T细胞失活或凋亡。随着对免疫分子生物学研究的深入，发现在T细胞表面存在众多的共刺激分子和共抑制分子，共同精确调控T细胞的活化。CTLA-4是表达于活性T细胞表面的重要的抑制分子，与CD28同源，其胞内段含有1个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM），与配体B7.1、B7.2结合后，ITIM基序能够募集SHP家族磷酸酶，逆转TCR活化导致的信号分子磷酸化，从而抑制T细胞活化。PD-1是T细胞表面另一个重要的抑制性受体，与CD28和CTLA-4具有同源性，因最初在凋亡的T细胞淋巴瘤发现，并能促进程序性细胞死亡而得名。并可诱导性地表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及单核细胞，在静息的淋巴细胞表面无表达。这些活化的淋巴细胞表面PD-1的表达上调能导致获得性或者固有免疫反应的抑制。其配体为B7-同源蛋白1（B7-homolog 1，B7-H1）和B7DCB7-H1也称程序性死亡蛋白配体-1（PD-L1）。PD-1胞内段含有1个ITIM基序和1个免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）。ITSM 基序介导了SHP家族磷酸酶的募集以及对T细胞活化信号的抑制。PD-1/PD-L1的结合对于调节T细胞激活和维持外周免疫耐受发挥重要作用。但是肿瘤细胞可以通过表达PD-L1进而与PD-1相互作用抑制T细胞活化，逃避免疫细胞的杀伤。T细胞表面重要的共抑制受体还包括BT淋巴细胞衰减蛋白（BTLA）、淋巴细胞激活基因3（LAG3）、CD160 和PD-1 同源分子（PD-1H）等。
二、实验目的和意义
针对免疫检查点的阻断是众多激活抗肿瘤免疫的有效策略之一。免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受。利用免疫检查点的抑制性信号通路抑制T细胞活性是肿瘤逃避免疫杀伤的重要机制。
三、实验内容
1.细胞的瞬时转染-----免疫检查点的治疗性抗体的表达
使用脂质体转染法，阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。
- 抗体预包被
将抗体铺在96孔板上，使得抗体固相化。CD3抗体激活T细胞活化的第一条信号，待测抗体激活T小包活化的第二条信号。
- 从血液中分离PBMC
外周血单个核细胞，指外周血中具有单个核的细胞。包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。
- 阴选T细胞
阴性选择指的是只有在胸腺髓质发育中不予自身抗原反应的T细胞才能生存。使用EasySeptrade;免疫磁珠细胞分选，分离出T细胞。
