开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
1.选题背景
甲胎蛋白(AFP)为肿瘤相关抗原,是原发性肝癌诊断和生物治疗重要的靶抗原。在此前的工作AFP 是最早发现的肿瘤标志物之一,其长期以来被作为肝癌、胎儿缺陷以及胚胎相关癌的重要血清分子标记物,是血液检验中的重要评价指标分子。除应用于产前诊断和肝细胞癌诊断外AFP的血液检测对肝损伤、肝硬化、肝炎、肠胃癌、神经管损伤、内胚窦瘤、生殖系统癌症等疾病的诊断及病情监控也具有重要意义。
单链抗体因为不需要蛋白表达后的糖基化修饰,因此可以采用比哺乳动物细胞更为廉价的大肠杆菌生产技术制备。但是目前大肠杆菌原核细胞表达单链抗体以没有生物功能的包涵体形式为主,经过包涵体变复性技术获得功能抗体的技术路线复杂、产率低且异构体严重影响产品质量,因此迄今尚不能够应用该技术路线生产抗体。应用大肠杆菌生产可溶性抗体是国内外小分子抗体的研究重点,但目前原核表达可溶性抗体的产量还非常低,表达不稳定,活性不稳定,因而探索高效表达可溶性小分子抗体的相关技术十分迫切。
在前期的工作中已成功利用大肠杆菌表达出可溶性抗IgE单链抗体,但其表达量较低,不利于该产品的大规模制备,直接影响该原创性新药实施产业化。因此本实验重点对影响大肠杆菌表达可溶性单链抗体产量的重要因素,包括表达宿主、培养基、诱导条件等进行优化,以提高可溶性抗体的高效表达,为后期大规模发酵和蛋白纯化及胶体金试纸条的制备提供支持。
2.研究的主要内容
改变条件使抗甲胎蛋白单链抗体的表达量增加,并将获得的单链抗体做成胶体金试纸条
3.研究的思路和方法
(1)菌种的选择:外源蛋白在大肠杆菌细胞质或者细胞周质中表达时,容易被宿主本身表达的蛋白酶降解。因此,选择蛋白酶缺失的宿主非常有利于外源蛋白的表达。以大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)为研究对象比较两者的表达量。
(2)培养基的选择:培养基的组成对可溶性外源蛋白的表达有显著影响。以LB液体培养基和玉米浆发酵培养基为研究对象比较表达产量。
