许多单克隆抗体药物作为单一药物虽然显示出一定临床治疗效果，但其治疗效果不佳，而化疗药物疗效较强，其毒副作用也较大，如在单克隆抗体上化学偶联上小分子化学药物，是提高抗体药物疗效的重要方法之一。抗体偶联药物能够协同发挥抗体的“特异性”靶向作用和高活性细胞毒类药物“高效”癌细胞杀伤作用。然而，抗体偶联药物的分子设计非常复杂，针对癌细胞不同靶点和药物适应症，需要同时充分考虑抗体、链接子和载荷药物的不同组合选择，尽管该类药物还存在诸多挑战，但最近临床研究的成功促使抗体偶联药物越来越受到极大关注和兴趣。 |
国际上Seattle Genetics、ImmunoGen和Immunomedic是抗体偶联药物研究领域的先驱和专业公司[12]。大型制药公司中，罗氏（基因泰克）借助ImmunoGen 构建了最大的抗体偶联药物研发管线和技术平台，辉瑞、雅培从Seattle Genetics 公司，礼来、诺华从ImmunoGen公司，默克从Ambrx公司分别引进抗体偶联药物技术平台或产品。 国内目前还没有抗体偶联药物产品上市，罗氏的抗体偶联药物 T-DM1 (Ado-Trastuzumab Emtansine)在2019年初已经提交上市申请，同时国内已有多家制药企业布局该类药物，截止2019年7月，我国至少已有18家企业申请了不少于16种抗体偶联药物产品的临床研究，近些年来国内抗体偶联药物研发创新及商业化发展迅速，相信不久的将来迎来该类药物产业的春天。 |
本课题内容为通过瞬转方式表达和制备高纯度单克隆抗体，将抗体和细胞毒素进行化学偶联制备抗体偶联药物(ADCs)制备的ADCs通过不同的纯化方法，将偶联2个、4个、6个、8个毒素的成分进行分离，并对各个成分进行鉴别和稳定性研究。 |
（1）通过瞬转方式表达和制备高纯度单克隆抗体： 生产单克隆抗体的杂交瘤技术，杂交瘤细胞就像一个高智能抗体生产工厂，可以不断生产性质相同的单克隆抗体。, 传统杂交瘤技术还存在制备周期较长, 成本较高, 杂交瘤细胞不稳定抗性会丢失等缺陷 。嵌合单克隆抗体产生于 1980 年代中期, 是应用 DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗 体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当的抗生素或试剂进行筛选, 再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株 。科学家对嵌合抗体进一步改进，得到了人源化单抗和全人单克隆抗体。目前, 嵌合单克隆抗体基本主宰着治疗性单抗的商品市场。 （2）制备抗体偶联药物(ADCs)： 通常药物与抗体的偶联是通过抗体上赖氨酸残基或链间二硫键还原产生的半胱氨酸残基实现的。实现位点特异性偶联的方法还包括使用非天然氨基酸、硒代半胱氨酸和酶解偶联法。 （3）纯化： 疏水相互作用色谱 HIC 可以用于纯化完整抗体偶联药物。 免疫亲和纯化 ADC 药物的方法，采用包被抗原的磁珠来分选抗体偶联药物，继而进行 RP-HPLC 分离和电喷雾四极杆飞行时间质谱( ESI-Q-TOF) 分析。 （4）对各个成分进行鉴别和稳定性研究： RP-HPLC方法测定药物抗体偶联比：蛋白质工程（使用定点诱变，在选定的位点进行缀合）--无细胞蛋白质表达和纯化--药物结合--DAR测定--体外血浆稳定性--HER2 ECD ELISA--细胞细胞毒性测定 DAR测定:稀释还原和完整的ADC溶液 色谱柱：Proteomix 色谱柱（ 5mu;m ， 1000Aring; ， 2.1times;150 mm， Sepax技术公司，Newark，DE） 流动相：0.1％三氟乙酸A）/水（流动相A， MPA）和0.1％TFA /乙腈（ACN）（流动相B，MPB） 流速：0.5 mL / min 柱温：80° 监测280 nm（参考波长为360 nm）波长处的吸光度和峰面积 DARlc = 2times; 共轭LC的峰面积 非共轭LC的峰面积 共轭LC的峰面积 DARhc = 2times; 共轭HC的峰面积 非结合HC的峰面积 结合HC的峰面积 ADR总 = ADRlc ADRhc 体外血浆稳定性: ADC在PBS、人血浆、猴浆、小鼠血浆和大鼠血浆中100mu;g/mL孵育5min、1d、2d、3d、4d和7d。 当收获时，100mu;L链霉亲和素磁珠被涂上10mu;g用于人血浆孵育或生物素的生物素-HER2-ECD(细胞外结构域和trastuzumab结合靶点)以及用于所有其他血浆孵育的抗-h FC，然后与100mu;L血浆样品混合，在25mu;L1%TFA中孵育5m in，在室温下将捕获的珠子ADC从磁珠中释放出来，然后在台式离心机中旋转混合物，上清液用于还原RP-HPLC分析。 HER2 ECD ELISA: 在4°C下，用0.5mu;g/mL HER2ECD包覆96孔ELIS A板，去除涂层溶液后，在室温下用阻断液[0.5%牛血清白蛋白(BS A)]阻断非特定结合位点1minus;2h。然后用洗涤缓冲液(PBS中0.05%吐温)洗涤平板，并在ELISA测定缓冲液中稀释标准或样品[含0.5%BSA、0.05%吐温、10ppm Proclin 300、0.2%牛g球蛋白，0.25%CHAPS，0.35M NaCl，5MEDTA(pH7.4)]。温育2小时后，洗涤板，并加入缀合有HRP的山羊抗人血清，并在室温下再温育2小时。 再次洗板，加入四联苯胺底物进行显色。加入1M磷酸，10minus;15min后停止反应，在波长为450nm的分子器件微板阅读器上读取平板。 从标准曲线的四个变量拟合推断样品中IgG的浓度。 细胞细胞毒性测定: 用细胞增殖法测定其对细胞的细胞毒性作用。将SKBR3细胞（每孔共103个细胞）在体积为40mu;L的96孔半区平底白色聚苯乙烯板中播种。在DMEM/F12介质中，在2times;浓度下制备ADC变体，并通过多屏HTS96井滤波器进行过滤。将过滤器灭菌，缀合或未缀合的曲妥珠单抗变体添加到处理孔中， 并将板在CO2 培养箱中于37°C 下培养最多7天。为了测量细胞活力，将80mu;细胞Titer-Glo试剂添加到每个孔中，并按照产品说明处理板。在ENVISION酶标仪上测量相对发光。使用未处理的细胞作为参照，将相对发光读数转换为生存力百分比。使用对 数（抑制剂）对响应，可变斜率，四参数拟合方程在图形垫棱镜上对数据进行非线性回归分析。数据表示 为相对细胞存活率％相对于ADC剂量的nM。 液质联用对一种抗体药物偶联物的药物抗体偶联比测定：首先进行样品的去糖化处理，具体数据按照具体情况更改，以下仅为参考： 色谱柱： Waters 公司的 Symmetry300 C4 分析柱 流动相：含0.1% 甲酸的乙腈，程序性洗脱（10%-90%） 流速： 0.2 mL·minminus;1 柱温：80 ℃ 质谱的采集范围为 m/z 500～3 500, 用 Biopharmalynx 软件对结果进行分析。 实验将 D0～D8的峰强做加和, 分别计算0～8 个药物偶联分别所占的百分比，D0 至 D8 所占的百分比做加权, 可以得到其偶联比。 紫外分光光度法对一种抗体药物偶联物的药物抗体偶联比测定： 稀释抗体偶联物--等比例稀释的配方缓冲做空白对照--238～300 nm 波长内做吸收度扫描，并选取 252 和280 nm 的吸收度。 抗体为蛋白质, 其含有苯环的氨基酸在 280 nm 有其特征性的吸收峰, 而整个蛋白由此产生在 280 nm 波长处的特定的消光系数, 而MCC 则在252 nm 有其特征性的吸收峰, 也会产生特定的消光系数。通过测量抗体偶联物在 280 nm 以及 252 nm 波长处总的吸收值，通过A280/A252 =(εAb.280 εD.280 times; gamma;)/(εAb.252 εD.252 times; gamma;)，计算抗体药物偶联比gamma; = CD/Cab。 |
2020年3月5日前 确定毕设课题 2020年3月6日——3月19日 阅读文献，查阅资料，撰写开题报告 2020年20日后ensp;ensp;收集资料，开展研究，形成论文初稿，论文修改、定稿、打印、答辩 |
(1).Abdollahpour‐Alitappeh M, Lotfinia M, Gharibi T, et al. Antibody–drug conjugates (ADCs) for cancer therapy: Strategies, challenges, and successes. J Cell Physiol. 2018;1–15. (2).Aditya Wakankar, Yan Chen, Yatin Gokarn amp; Fredric S. Jacobson，Analytical methods for physicochemical:characterization of antibody drug conjugates，Landes Bioscience. 2011;161-172 (3).Yiren Xu, Guifeng Jiang, Cuong Tran, Xiaofan Li, Tyler H. Heibeck, hellip;，Gang Yin，RP-HPLC DAR Characterization of Site-Specific Antibody Drug Conjugates Produced in a Cell-Free Expression System，Organic Process Research amp; Development，2016，Ａ-Ｉ (4).于传飞，李萌，郭玮等，一种抗体药物偶联物中药物抗体偶联比的测定，药学学报，2014, 49 (3): 363minus;367 (5).宋洪彬，刘冬连，李鹏飞，赵季冬，曲妍霏．抗体偶联药物发展与进展．药学学报. https://doi.org/10.16438/j.0513-4870.2019-0563 (6).王兰，夏懋，高凯，抗体偶联药物的研究进展与质量控制，中国生物工程杂志，2014，34( 4) : 85-94 (7).朱学泰，谢溱,马瑞君，单克隆抗体制备技术研究进展，甘肃科技，2015，21（3） |
