一、研究背景
1．beta;-carotene的特性及研究进展
beta;-carotene（C40H56）是由两个beta;-紫酮罗和四个异戊二烯组成的对称性结构的化合物beta;-胡萝卜素是深红色至暗红色，有光泽的斜方六面体或结晶性粉末,略有特殊臭味，熔点 176℃‑184℃[1]化学性质不稳定，遇氧、热、光不稳定,易在光照和加热时发生氧化反应，在弱碱情况下较稳定。beta;-胡萝卜素易溶于许多有机溶剂，如二氯甲烷、苯、四氯化碳，氯仿、甲苯、石油醚、己烷，微溶于植物油，几乎不溶于水、甲醇、乙醇、丙二醇、甘油[2]。属于天然的强抗氧化剂，能消除体内自由的，预防衰老，提高人体免疫力，抗癌，抑癌，预防心血管疾病和白内障，保健等特殊的生理功效，而具有广阔的应用前景。例如是食品添加剂中绿色纯天然的着色剂，营养强化剂和增补剂，化妆品中抗氧化剂延缓衰老的主要成分，高剂量的beta;-carotene会减少人们对太阳的敏感性，对那些因被太阳暴晒而引起的皮肤病具有良好的药用功效。
据文献介绍beta;-carotene的制备生产主要有3种方法:天然提取法,化学合成法和发酵法[3]。因化学法合成的杂质含量多导致人体吸收慢和较强的毒副作用，长期使用还会造成人体不可逆病变而限制了其使用，然而于植物中提取既对种植地区，面积，季节，气候，产地，提取纯化工艺等均具有较高要求，产量较低[4]。从成本上比较,植物提取法由于原料中有效成分低,因此生产成本过高,植物细胞培养法基因工程法培养条件苛刻,对反应器的要求高,增加了成本同时产量还会受到限制。基因工程法产量虽高,但是生产条件苛刻，其中微生物发酵法不受环境等条件的影响且产量高, 生产成本较低是目前生产beta;-carotene的最好方法[5]。三抱布拉氏霉菌具有易培养、干重大(70克/升发酵液)、产量高(2.5-3克/升)的优势,成为目前生产beta;-carotene的首选菌株,国际上主要是通过对三抱布拉氏霉菌发酵,其实验室发酵水平已达到(3-3.5g/L),工业生产上也达2.5g/L,发酵规模可达l0m3,以上。国内实验室发酵水平已达到了2.3g/L,生产水平可达1.146g/L,发酵规模为3m3[6]。根据 2007 年的统计，全球类胡萝卜素市场额达到 7.66 亿美元，且每年以 2.3%速率增长，在巴西市场中，20%的beta;-胡萝卜素粉末每公斤的价格为 215-240 BRL，而 2009 年全球类胡萝卜素市场额达到 10 亿美元，其中beta;-胡萝卜素占到了高达 30%的市场份额。目前，国际beta;-胡萝卜素市场主要由罗氏、巴斯夫、帝斯曼、默克、罗纳普朗克控制。
2 .利用三孢布拉氏霉菌合成beta;-carotene优势
丝状真菌三抱布拉氏霉菌生长迅速,生物量高,三孢布拉霉是异宗结合菌，进行有性生殖的方式是异宗接合，即由来源和性质不同的“ ”“-”菌株才能相互融合，进行有性生殖[7]。菌体内甲轻戊酸途径代谢通量大，是目前唯一可以工业化生产类胡萝卜素的优良菌种。beta;-胡萝卜素的生物合成途径主要为甲羟戊酸（MVA）途径。甲羟戊酸（MVA）途径合成所需要的底物主要来自糖类和脂类物质，它们经糖酵解途径和分解代谢途径产生的乙酰辅酶 A，3 分子的乙酰辅酶 A 缩合成甲羟戊酸，在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯，脱羧后形成异戊二稀焦磷酸（IPP)，异戊烯焦磷酸(IPP)是beta;-胡萝卜素合成的前体物质，IPP 在 IPP 异构酶作用下生成二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)，二甲基丙烯基二磷酸再与3个IPP缩合，依次生成牻牛儿焦磷酸(GPP)、法尼基二磷酸(FPP)和牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)。2 分子 GGPP 在八氢番茄红素合成酶(PSY)作用下形成第一个无色的类胡萝卜素——八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素[8]。番茄红素是类胡萝卜素进一步合成代谢的分支点：其中一条途径是在番茄红素beta;-环化酶的作用下产生beta;-胡萝卜素[9]。许多研究表明,一些促进剂的添加可以大大提高三孢布拉霉菌次级代谢产物的产量,但是其中的代谢调控机理并不十分清楚。本实验主要研究添加酮康唑和盐酸特比萘酚(麦角固醇抑制剂)对于三孢布拉氏霉菌发酵生物量及beta;-carotene的产量的影响。生物合成的beta;—胡萝卜素为细胞内产物,生产时需经破壁提取方能获得产品(做饲料添加剂时可直接使用菌体)。一般是在发酵培养结束后,收集菌体,脱水后用有机溶剂萃取,萃取液经浓缩、低温结晶和精制,即制成不同含量的油溶产品或水溶性粉剂[11]。
3. 番茄红素的研究意义
番茄红素是一种具有11个共扼双键的脂溶性不饱和碳氢化合物是类胡萝卜素的一种。分子式：C40H56，分子量为536.88，针状深红色晶体(从二硫化碳和乙醇混合液中的析出物)； 熔点：174℃，可燃。溶解性：不溶于水，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，易溶于二硫化碳、氯仿、苯、沸腾乙醚、正己烷等有机溶剂。番茄红素具有两大特点：(1)易氧化性。光照、温度、与氧接触、pH降低以及表面活性剂的作用均可使番茄红素发生降解；酸对番茄红素具有较强的破坏作用，而碱的影响则不大；(2)异构化性。番茄红素有72种顺式异构体结构。顺式结构与反式结构相比，物理化学性质的差异主要包括熔点的降低和消光系数的减小等，特别是消光系数的减小对于番茄红素的定量分析有一定的影响。在储藏和制备过程中，番茄红素的损失主要是由于发生氧化异构化和降解，因此要在低温、暗处保存，尽量避光。其对单线氧的消除能力是beta;-胡萝卜素的两倍抗氧化作用也明显优于beta;-胡萝卜素同时它还具有对自由基的清除阻断亚硝胺形成抑胞增殖诱导细胞分化增加免疫力减少DNA损伤以及促进细胞间隙连接通讯等作用。国内应用的番茄红素主要来自从番茄中提取与植物提取法相比,微生物发酵法具有生产周期短、产生菌更易于基因改造而大幅度提高产量等优势。对三抱布拉霉中番茄红素的代谢途径的研究表明,番茄红素经异戊二烯单位缩合而成并环化生成beta;-萝卜素等产物添加合适的环化酶抑制剂如叔胺或含氮的杂环类化合物,可阻断番茄红素到胡萝卜素的环化途径,大量积累番茄红素[11]。
二、研究目的
经过培养基优化和最适条件已经确定的基础上研究分别加入不同浓度麦角固醇抑制剂酮康唑和盐酸特比萘酚，以及培养加入的时间对实验菌体的生物量和beta;-carotene合成的影响和调控作用。
