鼠伤寒与肠炎沙门氏菌快速精准检测方法研究
韩宁
中国药科大学生命科学与技术学院
摘要：建立一种快速精准的鼠伤寒和肠炎沙门氏菌检测鉴定方法用于鉴定食品安全、食物中毒防控、环境污水监控、临床诊治及食品进出口贸易。挑选鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的两个特异性基因（STM4495、sdfI）为靶基因，设计聚合酶链式反应（PCR）引物及实时荧光定量PCR引物探针并优化，建立鼠伤寒和肠炎沙门氏菌的简套式荧光PCR方法（以普通PCR为外套，实时荧光定量PCR为内套）并以国家标准（GB4789.4—2016）为金标准，对建立的方法进行重要指标进行实验室比对与现场样本验证，比对指标有灵敏度、特异度、重复性、检测鉴定时间、检测鉴定经费、操作难易程度，比对结果进行综合评估。以下对即将实施的本课题具体研究内容进行逐一汇报。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、聚合酶链式反应、简套式荧光聚合酶链式反应
ABSTRACT: Construct a fast and accurate detect method of Salmonella Typhimurium and Enteritidis, which contributes to food safety, sitotoxism control, environmental sewage control, clinical diagnosis and food import and export trade. Select two specific genes(STM4495, sdfⅠ) of the two bacteria as target gene, design PCR and real-time PCR primers and optimize them in order to construct nested real-time PCR method of the two bacteria. Compare the method with gold standard(GB4789.4-2016) in lab and practice in sensitivity, specificity, repeatability, consumed time, cost and complexity of operation. Follows are report on aspects of the research.
KEY WORDS: Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Polymerase Chain Reaction, nested real-time Polymerase Chain Reaction
随着国际食品贸易的增加以及人们对于健康的关注提高，食品安全越来越受到重视。微生物食物中毒是食源性疾病的一个很重要的诱因，沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠杆菌O157:H7等是最主要的食源性细菌。在工业化国家中，每年约有10%的人口感染食源性疾病[1] 。FAO估计发展中国家每年发生的食源性疾病越有8亿例，其中亚洲约占5亿。据统计，在1999年-2005年期间，我国有报道的食源性疾病感染事件有12687件，共有289380人感染，其中2297人死亡[2]。细菌性感染占总数的28.25%，以沙门氏菌（22.16%）和副溶血弧菌（18.73%）为主要病原菌[2]。
沙门氏菌（Salmonella）广泛分布于世界各地，是是一群寄生在人类和动物肠道中，生化反应和抗原结构相关的革兰氏阴性菌，根据生化反应，DNA同源性等，沙门氏菌属（Salmonella）分为肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和邦戈沙门氏菌（Salmonella bongori）两个种。肠道沙门氏菌又分为6个亚种，即肠道亚种（subsp. enterica）、萨拉姆亚种（subsp. salamae）、亚利桑那亚种（subsp. arizanae）、双亚利桑那亚种（subsp. diarizanae）、豪顿亚种（subsp. houtenae）和英迪加亚种（subsp. indica）。沙门氏菌属细菌的血清型共检测出2610种[3]，但对人致病的只是少数，如引起肠热症的伤寒及副伤寒沙门菌、引起食物中毒或败血症的鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌、鸭沙门菌等十几个血清型。沙门菌大小0.6～1.0times;2～4微米，除鸡沙门菌和雏沙门菌等个别外都有周身鞭毛、无芽孢，无夹膜。对营养要求不高，不发酵乳糖或蔗糖，对葡萄糖、麦芽糖和甘露糖发酵，除伤寒沙门菌不产气外，其他沙门菌均产酸产气。能在很大的温度范围内生长，其中最适温度为35-37摄氏度[4]。主要存在于肉、蛋、水产品等食物及生活污水中。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhimurium）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica subspecies enterica serotype Enteritidis）是引起食源性疾病的的主要血清型，欧盟的沙门氏菌病发病率为34.6/10万[5]。全球每年有超过1亿人感染沙门氏菌，其中因此死亡的达15.5万人，以东南亚地区为最[4]。
