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一、研究背景 动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）,是心血管系统最常见的一种极具危害性的疾病。AS病变发生最初为脂质和复合糖类积聚，继而纤维组织增生及钙质沉着，并伴随有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，从而导致出血及血栓形成；一旦动脉管钙化程度发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死[[1]]。 高密度脂蛋白(Highdensity lipoprotein,HDL) 是存在于人类血浆中的一种天然生物活性物质，是密度最高（1.063~1.25010^3g/L）、体积最小的一类脂蛋白，其直径约为5.8~13.0nm，HDL是一类异质性脂蛋白，由50％的蛋白、30％的磷脂、25％的胆固醇(其中70％为胆固醇酯)、5％的三酰甘油组成。不同的HDL亚类在颗粒大小、性状、密度、电荷、抗原性、理化性质以及生物学功能上均有很大差异[[2]]。根据HDL形状及大小的不同，可分为盘状HDL和球状HDL。盘状HDL体积较小，主要由载脂蛋白、磷脂、游离胆固醇组成的磷脂双层结构构成。球状HDL体积较大，由磷脂单层膜包被一个由胆固醇酯及甘油三酯组成的疏水核心构成；根据HDL密度的不同，可分为HDL2(密度范围1.063~1.125 g/ml)、HDL3(密度范围1.125~1.210 g/ml)和极高密度脂蛋白（VHDL,密度范围1.210~1.250 g/ml），随着HDL颗粒密度的增大，其抗LDL氧化的能力逐渐增强；根据所含载脂蛋白种类的差异，HDL可分为仅含apoA-I的HDL和同时含apoA-I及apoA-II的HDL[[3]]。HDL主要由肝脏及小肠黏膜细胞合成，这是一个由多种膜蛋白和胞质蛋白参与的复杂过程。初合成分泌入血的新生HDL含有极少量极性脂质和一分子载脂蛋白A-I（apolipoprotein,apo-AI）,分子呈小颗粒状。Apo-A-I是HDL主要的结构蛋 白，约占HDL总蛋白的70%左右，在HDL亚类组成、分布以及成熟代谢中具有重要作用[[2]]。 apoA-I在肝脏和小肠中分泌而得，它最主要的功能是与细胞内受体相互作用，活化卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（lecithin/cholesterol acyltransferase,LCAT）赋予HDL的多种抗动脉粥样硬化活性。分泌的apoA-I与ABCA1产生功能性相互作用，导致细胞内磷脂和胆固醇流向贫脂apoA-I。酯化的apoA-I逐渐转变为富含未酯化胆固醇的圆盘状颗粒。随即LCAT催化游离胆固醇酯化，从而使得从圆盘状HDL转变为球形HDL。ApoA-I、ABCA1和LCAT的相互作用，在HDL的合成过程中起到十分重要的作用。研究发现，apoA-I、ABCA1和LCAT缺陷或突变失活可阻止含apoA-I的HDL合成[[3]]。 HDL具有多种功能，1）逆向转运胆固醇（reverse cholesterol transport，RCT）功能：可将血液中多余的胆固醇转运到肝脏；2）抗炎作用：抑制炎症细胞因子产生，抑制白细胞浸润及自由基迁移；3）抗氧化作用：通过多种机制抑制低密度脂蛋白氧化；4）抗血栓作用：抑制血小板的活化和聚集，抑制血管内皮细胞凝血酶介导的组织因子产生，抑制X因子，升高S蛋白和C蛋白活性；5）抗细胞凋亡作用：抑制氧化LDL通过阻止细胞内信号转导而引起的细胞凋亡，促进肿瘤滑丝因子的凋亡及细胞生长因子缺陷引起的凋亡；6）血管扩张作用：刺激一氧化氮的产生[[4]]。其中HDL最重要的功能是RCT。人体中HDL的RCT过程大概分为：a. 组织细胞中胆固醇的流出，新生盘状HDL作为外周组织细胞内游离胆固醇最初接受体，胞内胆固醇在ATP结合盒转运子A1/G1（ATP-bin-ding cassrtte transporterA1/G1,ABCA1/ABCG1）介导下出胞并与HDL中ApoA-I结合，变为HDL-C。b. 胆固醇的酯化，盘状HDL在接受游离的胆固醇后，在LCAT的作用下将胆固醇酯化，使胆固醇进入HDL核心，从而使得其表面能不断地接受出胞的游离胆固醇；随着HDL核心胆固醇酯含量逐步增加，形成不同亚类的HDL-C，待HDL达到运载胆固醇的最大量，即成为成熟的球状HDL-C。c. 胆固醇的清除。 成熟球状HDL-C经肝脏摄取胆固醇酯后，重新变成HDL，进入血浆再次循环[[5]]。将HDL的RCT能力作为预测发生心血管事件风险的指标，发现这一指标越大，发生心血管事件的风险越小。 此外，研究表明，血浆中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平与AS的发病率呈正相关性，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与AS的发病率呈负相关性。HDL保护心血管的作用是多方面的。目前认为HDL的抗AS作用，可分为两类：1）与脂代谢功能有关的抗AS作用：HDL参与胆固醇及氧化胆固醇的逆向转运，即HDL通过SR-BI介导肝外组织细胞胆固醇、氧化胆固醇流出以及转运肝脏代谢的过程，由此降低血浆中胆固醇的水平；HDL能够抑制LDL的氧化以及降低氧化LDL引起的损失。2）与非脂代谢功能有关的抗AS作用：HDL抑制单核细胞粘附和迁移到血管壁；刺激内皮细胞修复和增殖；抑制生长因子诱导的血管平滑肌细胞的增生；预防血栓的形成[[6]]。 二、研究目的 他汀类药物是羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，研究指出他汀类药物在心血管疾病患者中发挥作用可能与其改善HDL功能，从而延缓患者动脉粥样硬化的进展有关[[7]]。 重组高密度脂蛋白（reconbinantHDL，rHDL）是一类利用磷脂、游离胆固醇、载脂蛋白和非极性脂质材料制备而成的新型仿生纳米载体，可模拟天然高密度脂蛋白的性质和功能。具有高密度脂蛋白所具有的高效运载性、高度安全性、特异靶向性及极强的穿透性。重组高密度脂蛋白采用内源性高密度脂蛋白的成分为材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，本身能避开网状内皮系统的识别而获得较长的半衰期，它能够以被动靶向或主动靶向的方式递送药物。根据HDL对清道夫受体B1（SR-B1）的高度亲和力，实现靶向于高表达SR-B1受体的肝细胞或肿瘤细胞，或经表面修饰（如连接上一定的单克隆抗体或某受体相应的配体）后实现主动靶向。天然HDL从新生盘状在HDL酶的作用下接受胆固醇，然后酯化进入脂质核心，最终变构成球状HDL。所以，选择球状rHDL相比于盘状rHDL具有更加稳定的结构，较大的脂质核心作为脂溶性药物的贮存空间，内源性可完全降解以及不被网状内皮系统识别和清除的特性，使得球状rHDL作为药物的载体，在提高药物靶向分布、增加药效等方面显示出独特的优势。 因此，本课题拟采用仿生性球状rHDL纳米粒来包载他汀类药物，并将药物特异性运载至AS斑块部位，从而产生载体与药物协同的抗AS效果。 三、研究思路及过程 重组球状高密度脂蛋白为核壳结构，其外层为单层膜，人工合成时，可采用以无机纳米粒子（如金纳米粒）作为模板的合成方法，控制颗粒的大小、形状及表面化学性质[3]。也可以脂质材料为核心，制备重组球状高密度脂蛋白，药物可存在于脂质核心区域。 常见的纳米脂质载体制备方法主要有高压匀质法、熔融超声法、溶剂乳化蒸发法、高速搅拌超声法、薄膜分散法等。其中高压匀质法每次制备的样品量至少在100mL以上，造成原料的浪费，因此实验室小试不适合用此方法制备。结合制备方法本身特点以及实验室条件，筛选出薄膜分散法。 （一）核心纳米粒的制备 （二） HDL的制备 1、脂质膜的制备 2、纳米粒核心与脂质体的混合 3、载脂蛋白ApoA-I的提取 4、在胆酸钠的介导下将ApoA-I孵育脂质体与核心的混合物上。成功制备出球状洛伐他汀仿生重组高密度脂蛋白，以粒径和包封率为指标，筛选出最优处方，优化工艺条件，并获得体外评价均符合要求的制剂，为后期筛选出协同作用最强的载药系统做好充分的准备。 四、参考文献 [1] RaphaelDuivenvoorden，Jun Tang，David P.Cormode，et al. 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