开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
S100 蛋白 (S100 proteins) 最早于 1965 年由 Moore首先在牛脑中发现， 因其在中性 pH 条件下能溶解于 100% 饱和度硫酸铵中而得名。[1]人类S100A8基因编码一个由88个氨基酸残基构成的小分子蛋白(calgranulin A蛋白，或称MRP8蛋白)[2]，而S100A9基因编码一个相对分子质量约14 000的蛋白质(Calgranulin B蛋白，或称MRP14蛋白)。S100蛋白在髓系细胞中大量表达，是一种含有保守 EF 手型结构的钙离子结合蛋白，目前已知蛋白种类超过20多种，分别表达于不同组织、细胞中[3, 4]。S100蛋白作为细胞内调节因子通过与酶、细胞骨架亚基、转录因子和核酸等相互作用，调节自身生物学功能，如参与调节蛋白磷酸化、细胞增殖、分化以及钙离子稳态等，也可通过自分泌或旁分泌作为细胞外信号蛋白与靶细胞表面 G 蛋白偶联受体（GPCR）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）等受体相互作用，参与调节炎症反应、细胞增殖和凋亡等[5]。
人的20个S100基因中，有16个(即S100A1～16)位于染色体1q21上，由3个外显子和 2 个内含子组成[6, 7]。小鼠的S100 同源基因位于3号染色体的同线区。这些S100基因聚集区在进化过程中高度保守。在人类和小鼠，编码S100A8的基因与编码 S100A9 的基因均处于毗邻的位置[8]。
S100A8和S100A9在体内可通过形成同源二聚体或异二聚体发挥作用。早期研究发现S100A8、S100A9只表达于髓源性细胞，如中性粒细胞及活化的巨噬细胞[9]，并且与炎症发生密切相关，在皮肤慢性炎症扁平苔癣的表皮及真皮组织中的表达高于正常皮肤组织[10, 11]。此外，由骨髓来源的抑制性细胞分泌的 S100A8、S100A9，可作为趋化因子促进炎症发展。外源性S100A8和 S100A9蛋白也可通过诱导炎性因子如白细胞介素1beta;（IL-1beta;）[12]、肿瘤坏死因子alpha;（TNF-alpha;）[13]、IL-17、IL-6等表达，在炎症反应中发挥重要作用[14, 15]。
- 要解决的问题
- 分别对S100A8/A9蛋白进行质粒克隆构建，并摸索出相应的蛋白诱导表达条件
- 通过AKTA对A8/A9蛋白进行纯化和浓缩
- 构建S100A8/A9抑制剂筛选平台
- 研究方法和内容
1.质粒无缝克隆技术：
无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。
1、位点选择灵活：载体任意位置基因克隆；
2、快速简便：省略酶切、割胶回收、酶连等过程，大约1h完成载体构建；
3、精确：不需要增加任何额外的程序；
