开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 实验背景
3,5-环磷酸腺苷（cAMP）和 3,5-环磷酸鸟苷（cGMP）是哺乳动物细胞中重要的第二信使，调节细胞功能，介导许多的生理过程[1-4]；其体内降解的唯一途径是磷酸二酯酶 (cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE)) 催化的水解，PDE可专一性水解cAMP，使其水解为非活性形式的5′-AMP从而终止调节作用。哺乳动物中，PDE家族一共有11种同工酶（PDE1- PDE11），PDE存在明显的细胞和组织特异性[5]。炎性细胞和免疫细胞中都以磷酸二酯酶同工酶 4 (PDE4) 为主，磷酸二酯酶4 (PDE4)在与气道炎症性疾病相关的炎症和免疫细胞类型中高度表达。PDE4的抑制会导致细胞内cAMP浓度的上升，并产生广泛的抗炎作用，包括细胞内外物质交换，微血管渗漏，细胞因子和趋化因子的释放，活性氧的产生以及细胞粘附分子的表达升高。PDE4也在肺结构细胞，包括肺纤维细胞，气道上皮细胞，血管内皮细胞以及气道和血管平滑肌细胞中表达。因此，PDE4抑制剂不仅可以减轻肺部的炎症反应，而且可以减缓肺部纤维化，血管重构以及黏液纤毛功能障碍（粘液分泌过多和粘液转运减少，许多肺部疾病的病理学特征）。PDE4的药理作用已在众多疾病模型中得到验证[6]。因此，PDE4抑制剂对于肺部疾病治疗具有重大的意义。
目前对 PDE4 同工酶的研究最为广泛。PDE4共有四种亚型，它们在细胞和组织中的表达存在差异，功能和分布也因细胞和组织类型而不同[7]。PDE4的4种亚型（A、B、C、D）的序列同源性非常高，每个亚型下面又包含不同的亚亚型。不同的PDE4亚型具有不同的N-端区，可以以特异的N端结构为靶点，从而发现PDE4 亚型选择性抑制剂。
磷酸二酯酶 4（PDE4）抑制剂是可抑制免疫和炎症细胞的新型抗炎药物。目前有罗利普兰(Rorlipram)、西洛司特(Cilomilast)、罗氟司特（Roflumilast）等。第一代 PDE4 选择性抑制剂如罗利普兰(Rorlipram)，具有抑制呼吸道肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺的作用，但有许多严重的副作用，尤其是对大多数中枢神经系统兴奋，以及呕吐等不良反应，限制了其临床发展，仅作为研究试剂。经过结构优化，第二代 PDE4 选择性抑制剂西洛司特(Cilomilast)，其部分实验结果在药物疗效及安全性方面均与预期不同，已停止使用；罗氟司特（Roflumilast），是 COPD 治疗的新型药物，它用于治疗严重COPD 患者支气管炎相关咳嗽和黏液过多的症状，其致呕吐副作用已明显改善，但仍是剂量限制性应用。PDE4 亚型的特异性抑制剂，或许有可能降低药物的不良反应，同时仍保持药物的抗炎活性，因而有可能研究制备出比目前第2代PDE4 抑制剂更好的抗炎药物。
计算机辅助药物设计（computer-aided drug design method）在新药开发过程中占有重要地位。虚拟筛选是基于计算机的方法在生物结构的基础上发现新的配体的过程。理论上讲通过计算机进行数据库筛选过程都叫做虚拟筛选[8]。近年来，计算机硬件和计算化学与物理学理论的迅猛发展，虚拟筛选已逐渐成为开发新型治疗药物的主要策略[9]。虚拟筛选是 CADD 技术中应用最为成功的一项技术，是对其深入探究与拓展[10]。目前主要的方法有基于结构的药物设计（structure based drug design，SBDD）和基于配体的药物设计（ligand based drug design，LBDD）[11,12]。SBDD类似于高通量筛选，生物大分子以及配体的结构都应当是已知的，主要包括：配体对接，药效团和配体设计。LBDD只能通过对配体结构来预测活性，取决于其与已知活性配体的差异，主要包括：基于配体的药效团构建，分子结构参数以及定量构效关系。目前已经开发了各种基于配体和结构的方法来构建药效团模型，并且已经被成功地广泛地应用于虚拟筛选的从头设计和引导优化过程中[13]。众所周知，新药开发周期长，成本高，而CADD可以降低药物研发成本，提高新药开发效率，缩短新药发现时间，相较于传统新药发现过程大幅度提升。目前已知世界各大医药公司如merk,abbott均投入重金在虚拟筛选软件开发部门[14,15]。因此，CADD在新药开发领域逐渐成为科学研究的热门。
二．实验目的及意义
本课题旨在利用虚拟筛选手段结合传统实验方式，筛选出具有特异性抑制PDE4活性的新型结构的抑制剂。目前，PDE4 选择性抑制剂的筛选，是通过测定 PDE4 活性的改变来实现的。常用的 PDE4 活性测定方法是以[3H]-cAMP 为底物，经 5rsquo;-核苷酸酶脱磷酸化，由放射性的环核苷酸中释放出来核苷，对该核苷用荧光液体进行定量检测。放射性物质存在辐射，此方法危害大且操作有局限性，不宜使用。LANCE Ultra cAMP Kit是基于时间分辨荧光共振能量转移原理定量测定细胞中的cAMP的含量。其利用铕标记的cAMP和未标记的cAMP与特异性结合抗体Ulight竞争性结合，给予320nm的激发波长，分别在615nm和665nm出检测荧光信号，可以用此方法进行测定，本课题基于此用以测定 PDE4 的活性和抑制剂筛选。
三．实验内容
- 虚拟筛选
- 磷酸二酯酶抑制剂筛选
- 候选化合物的细胞毒筛选
- 候选化合物的药物代谢动力学评价
四．参考文献
[1]Witt O, Deubzer HE, Milde T, Oehme I. HDAC family: What are the cancer relevant targets[J]. Cancer letters 2009; 277(1): 8-21.
